NÖVÉNYI BIOTECHNOLÓGIA Oktató: Kovrig Zoltán E-mail cím: kovrigz@yahoo.com Tel: 0745401393

Mi is a biotechnológia? „A biokémiának, a mikrobiológiának és a műszaki tudományoknak az integrált felhasználása, annak érdekében, hogy mikroorganizmusoknak, tenyésztett sejteknek, vagy ezek egyes alkotórészeinek (pl. enzimeknek) valamely képességét ipar termelési célokra alkalmazzuk” - Európai Biotechnológiai Szövetség

1. Klasszikus biotechnológia (biológiai technológia): Olyan gyártási eljárás amelyben valamilyen szervezet (pl. mikroorganizmus) vagy annak alkotó részei (pl: enzimek) egy termék előállítását végzik (műszaki aszpektus) Gyógyszeripar Élelmiszeripar Takarmánytartósítás Főként mikrobiális fermentáció, erjesztés, klasszikus nemesítés

2. Modern biotechnológia: új biotechnológiai eljárások - melyben az ember által meghatározott célból genetikailag módosított élő szervezetek vesznek részt - mikroorganizmusok - növényi sejtek - állati sejtek - növények - állatok

Géntechnológia: - egy gént egy élőlényből kiemelünk és átültetjük egy másikba - nehézsgek: A gén nem épül be Nem várt módon nyilvánul meg Hatás más génekre

3. Növényi biotechnológia: a növények szaporodásnak (reprodukció biotechnológiái), valamint genetikai programjának (géntechnológia) megváltoztatását és az így kialakított növényfajták képességeinek technológiai alkalmazását jelenti. Géntechnológiával módosított, ún. transzgénikus növények: amelyek sejtmagjába (genomjába) a géntechnológia molekuláris módszereivel idegen gént (transzgént) juttatnak be és az integrálódik, működik és öröklődik.

Abban különböznek a hagyományos növényektől, hogy a növény minden sejtje sejtmagjában általában egy vagy több transzgént, és citoplazmájában ezekről a génekről szintetizálódott fehérjéket tartalmaz. A növényi biotechnológia tárgya: A növények örökítő anyaga (DNS) ill. az azt hordozó legkisebb totipotens élő egysége, a növényi sejt - teljes genetikai információkészlete van. Nem ismerünk olyan sejtnél kisebb egységet, amelyből intakt növényt lehetne regenerálni.

A növényi biotechnológia célja a növény genetikai információjának módodításával új, gazdaságilag értékes fajták, hibridek előállítása, és új termesztési technológiák kidolgozása. Felhasználás: Ipar, mezőgazdaság: (kórokozó rezisztencia, mikroszaporítás, klónozás, energiatermeltetés) Egészségügy (kórokozók kimutatása, gyógyszerhatóanyagok termeltetése) Környezetvédelem (szennyezőanyagok kimutatása és lebontása, biodegradáció).

Egy kis genetika ..... Mi is a genetika? Sokan az öröklődés tudományaként definiálják. A genetika elnevezés a "gén" szóból ered, és a gének képezik a tudományág tárgyát.

A genetikát, mint elvek és analitikai eljárások rendszerét az 1860-as években alapította meg a moráviai ágostonrendi szerzetes Gregor Mendel.

A génekkel és a genetikai anyaggal kapcsolatosan 3 alapkérdés vetődik fel: 1.) Milyen a gének struktúrája? Hogyan kódolódnak az egyes sajátságok, és a kódolt információtól hogyan jutunk a funkcióhoz? 2.) Hogyan jutnak az egyes gének - és jellegek - tovább a generációk során ilyen pontossággal? 3.) Hogyan vezettek a genetikai anyag megváltozásai a múlt és a jelen biológiai diverzitásához?

Eukarióta: valódi, sejtmaghártyával határolt sejtmaggal rendelkeznek: növények, állatok, gombák

Prokarióta: nincs valódi, maghártyával határolt sejtmag Vírusok, baktériumok

Az eukarióta sejt felépítése sejtmag Sejtmagvacska: rRNS szintézis, riboszóma alegységek összekapcsolódása Sejtmaghártya Kromoszómák (= kromatin állomány): örökítő anyag citoplazma Centriolum (sejtközpont): sejtváz riboszómák Durva endoplazmatikus retikulum (DER) Sima endoplazmatikus retikulum (SER): poliszaharid és lipidanyagcsere Golgi komplexum: fehérjék módosítása, szétválogatása, szekréciós granulum képzés Mitokondriumok: sejtlégzés, energiatermelés Kloroplasztis: fotoszintézis Lizoszómák: sejten belüli emésztés sejthártya: védelem, anyagforgalom, információcsere, sejtkapcsolódás Sejtfal: védelem Sejten belüli mozgások fehérjeszintézis

Egy élőlény fokozatos nagyítása a genetikai anyag szempontjából

Mi teszi a fajokat azzá, amik? A gének határozzák meg egy faj örökletes tulajdonságait. A legtöbb gén egy aminosav láncot kódol. A fehérjék ilyen aminosav láncokból állnak. Amit mi egy szervezetben látunk, az vagy egy fehérje, vagy valami amit egy fehérje tesz. Ugyanazon faj egyedeiben, ugyanazon funkciókat betöltő fehérjéket kódoló gének vannak jelen.

Mi okozza a fajokon belüli változatosságot? A különböző funkciókat betöltő fehérjéket kódoló géneknek több változata is létezhet. Ugyanazon gén változatai az allélek. Az allélek változatossága okozza a fajokon belüli változatosságot. Fehérjeszinten az allélek változatossága a fehérjék közti különbségekben jelentkezik.

Gén – Az öröklődés fizikai és funkcionális alapegysége, amely egy meghatározott információt hordoz; a DNS egy szakasza, amely átírt és szabályzó régióból áll Genom – a szervezet teljes, sejtmagban található génállománya.

A legtöbb szervezetben a genom 2 példányban van jelen A legtöbb szervezetben a genom 2 példányban van jelen. Az ilyen szervezetek diploidok. Néhány élőlény (baktériumok, algák, gombák) sejtjeiben a genom csak 1 példányban van jelen. Ezek az élőlények haploidok. Maga a genom, egy vagy több hosszú DNS molekulából áll, amely(ek) kromoszómá(k)ba rendeződnek. A gének ennek a DNS molekulának a hosszabb – rövidebb régiói, amelyek egy polipeptidlánc szintéziséért felelősek. Minden kromoszómán a gének bizonyos sorrendben helyezkednek el. A diploid sejtekben a gének két példányban vanak, a homológ kromoszómákon.

A gének alaptulajdonságai Replikáció – ahhoz, hogy az örökletes anyag be tudja tölteni az életben betöltöltött funkcióit, le kell tudjon másolódni. DNS: kettős hélix, 2 antiparalell szál, amely nukleotidokból épül fel. DNS replikációkor ez a két szál elválik és 1 – 1 régi szál mellé új szál szintetizálódik.

2. Forma képzés (transzkripció – transzláció) A struktúrák, amelyek felépítik a szervezetet, mind valamilyen anyagból, szubsztanciából állnak. Ezen anyag (a fehérje) képződéséhez szükséges információt hordozza a DNS Az információ a DNS nukleotidjainak a sorrendjében van kódolva. Ez fordítódik át aminosavsorrendé két lépésben I. a sejtmagban: DNS  mRNS II. a citoplazmában a riboszómákon: mRNS  aminosav sorrend

3. Mutáció – az örökletes anyag megváltozása következmény: új allélok (=új formák) képződése

A génműködés egyszerűsített képe egy eukarióta sejtben

A genetikai információ áramlása egy eukarióta sejtben A sejt mikroszkópban látható részei: sejtmag kromoszóma maghártya citoplazma riboszómák membrán hálózatok endoplazmás retikulum Golgi készülék sejtszervecskék mitokondrium kloroplaszt sejthártya

A kromoszómák egyes szakaszai génként működnek A kromoszómák egyes szakaszai génként működnek. A gének működhetnek folyamatosan, a gének működése függhet külső jelektől, amik származhatnak a sejteken belülről vagy a sejten kivülről. A génműködés eredménye a gént alkotó DNS RNS másolata. Az elsődleges RNS másolat a sejtmagban érési folyamaton megy át (egyes szakaszai kivágódnak, végekre jellegzetes képletek szerelődnek), majd kijut a citoplazmába, mint hírvivő, vagy mRNS.

A szabad riboszómákon készülő fehérjék egy része olyan részletet tartalmaz, aminek segítségével bejut a sejtszervecskékbe és ott fejti ki aktivitását. A sejtszervecskéknek saját kromoszómája és génjei is vannak. A sejtszervecskék génjeiről is mRNS készül, amik a sejtszervecske saját riboszómáin fordítódnak le fehérjévé.

Az endoplazmás retikulumhoz kapcsolódó mRNS-ekről készülő fehérjék bejutnak a retikulum üregébe. Itt különböző cukor vagy zsírsav származékok kapcsolódhatnak kovalensen hozzájuk és veszik fel negyedleges szerkezetüket. A retikulumról lefűződő Golgi készülék a sejthártyához szállítja ezeket és kiürülnek a sejtek közötti térbe. Ezek hozzák létre a sejtek közötti állományt.

Ez a modern biológia központi alapelve, centrális dogmája. A genetikai működés egységes az egész élővilágban. A genetikai információ a DNS-től RNS fehérje irányban áramlik. Minden élőlényt, ahogy látjuk, vagy fehérjék, vagy a fehérjék aktivitásának terméke alkotja. Ez a modern biológia központi alapelve, centrális dogmája.

Gének és környezet A gének aktivitásának eredménye - leszámítva a tRNS és rRNS géneket -, hogy fehérje képződik. A fehérje 3 alapvető funkcióval bírhat, a géntől függően : A fehérje lehet strukturális. Az ilyen fehérjék a sejt vagy a szervezet fizikai sajátságait határozzák meg - mikrotubulusok - izomfehérjék - hajfehérjék

(2) Enzimek: katalizálják a sejt kémiai reakcióit. (3) Szabályozó fehérjék: szabályozzák más gének aktivitását. A gének nem magukban hatnak. A környezet szerepe fontos. A gének közreműködésével az élőlények létrehozzák azt a rendezett "folyamatot", amit életnek nevezünk a külvilág "rendezetlen" komponenseiből.

Genotípus és fenotípus fogalmai Hogy különbséget tehessünk az öröklődő gének és a fejlődés után létrejövő sajátságok között, megalkották a genotípus és a fenotípus fogalmát. Ha két egyed génjei megegyeznek, azonos genotípusuk van. Ha megjelenésük vagy funkciójuk egyezik meg, azonos fenotípusról beszélünk. Genotípuson szigorú értelemben az egyed összes örökölt génjét értjük. Fenotípus, szigorúan véve az egyed morfológiája, fiziológiája, viselkedése, és ökológiai kapcsolatainak összessége.

Alacsony oxigén koncentráció A sarlósejtes vérszegénység fenotípusának kialakulása Apró változás a hemoglobin gén DNS-ében hemoglobin A helyett hemoglobin S fehérje képződik Alacsony oxigén koncentráció a környezetben A hS molekulák kristályszerűen kicsapódnak a vörösvértestekben A vörösvértestek alakja sarlószerűvé változik A vértestek szétesnek Keringési zavarok A vértestek elakadnak a lépben vérszegénység egyéb szervek károsodása szívprobléma agykárosodás lépkárosodás gyengeség mentális betegség tüdőgyulladás reuma vesebetegség

A DNS szerkezete és replikációja Az örökítő anyag, - a DNS - szerkezetét és működésmódját 1953-ban írta le James Watson és Francis Crick.

A DNS örökítőanyag mivoltának bizonyítéka I A DNS örökítőanyag mivoltának bizonyítéka I. A transzformáció felfedezése (Frederick Griffith 1928) S törzs R törzs A Streptococcus pneumoniae virulens, S törzsével beoltott egerek tüdőgyulladásban elpusztulnak, az R törzzsel beoltottak túlélnek.

A transzformáció felfedezése Griffith kísérlete, 1928 A hővel elölt S baktériumok és az élő nem-virulens R baktériumok keverékével beoltott egerek elpusztulnak. A hővel kezelt S törzs nem pusztítja el az egereket. Az utolsó kísérlet döglött egereiből élő S baktériumok tenyészthetők ki. Az elölt baktériumok anyagából valamint az R baktériumokat S-é alakította át (transzformálta).

O. Avery, C.M. Mac Leod és M. McCarty kísérlete, 1944 A transzformáló anyag a DNS. O. Avery, C.M. Mac Leod és M. McCarty kísérlete, 1944 + DNA Az S sejtekből kivont anyagokból egyedül a DNS az, amivel az R sejtek S formává alakíthatók. Tehát a DNS a transzformáló anyag. Ez a kísérlet igazolta először, hogy a gének DNS-ből állnak.

Néhány vírusnak RNS az örökítő anyaga Ennek bizonyítása dohány mozaik vírussal: 1., Az RNS-ről eltávolították a fehérje burkot. 2., Az egyik törzsből tisztított RNS-t egy másik törzsből tisztított fehérjeburokkal keverték össze. 3., A „hibrid” vírussal levelet fertőztek. 4., A levélből kinyert vírusok az RNS-t adó törzs tulajdonságait hordozták.

Mit kell „tudnia” a genetikai anyagnak? 1., Rendelkeznie kell az információ tárolásának és működtetésének képességével. 2., Képesnek kell lennie ezen információt pontosan megkétszerezni és változatlan formában továbbadni. 3., Rendelkeznie kell a változékonyság képességével. A DNS ismert kémiai szerkezete túlságosan egyszerű felépítésűnek tűnt ahhoz, hogy a fenti feladatoknak megfelelhessen.

A DNS kémiai összetevői

A DNS kémiai összetevői A DNS kémiai felépítésének alapegysége a nukleotid. A nukleotid foszfátot, deoxiribóz cukrot és négy szerves bázisból egyet tartalmaz. A négy bázis az adenin, a guanin, a citozin és a timin. A cukor és a bázis alkotta egység a nukleozid: deoxiadenozin, deoxiguanozin, deoxicitidin, deoxitimidin. A nukleotidok teljes kémiai neve: rövidítése deoxiadenozin 5’-monofoszfát, dAMP - A deoxiguanozin 5’-monofoszfát, dGMP - G deoxicitidin 5’-monofoszfát, dCMP - C deoxitimidin 5’-monofoszfát, dTMP - T

A Chargaff szabályok (1955) Kölönböző élőlényekből kivonható DNS összetételének vizsgálata érdekes törvényszerűségeket tárt fel. A törvényszerűségeket Erwin Chargaff ismerte fel: Az élőlényekből származó DNS-ekben a pirimidin nukleotidok (T + C) mennyisége egyenlő a purin (A + G) nukleotidok mennyiségével. A T mennyisége egyenlő az A-val, és C mennyisége egyenlő G-vel. Azonban A + T és C + G mennyiségek nem feltétlenül egyenlők, azok aránya jellemző az élőlényre amiből a DNS származik.

Példák a Chargaff szabályokra

A DNS kettős spirál

A DNS elsődleges szerkezete: polinukleotid lánc A modellben a víztaszító bázisok belül, a cukor és foszfát csoportok kívül helyezkednek el. Minden bázispár egy purint, (A vagy G) és egy pirimidint, (T vagy C) tartalmaz. Az A-T párt 2, a G-C párt 3 hidrogénhíd stabilizálja. A két szál komplementer (meghatározza és kiegészíti egymást). Az antiparallel irányultságot a cukor 5 3’ iránya adja.

A DNS kettős spirál létra modellje A létra modellen jól látszik, hogy a bázispárok létrafokként helyezkednek el a szerkezet belsejében. A cukor gyűrű síkja majdnem merőleges a bázisok síkjára. A víztaszító bázisok szoros egymásra fekvése a víz kiszorítása által erősen stabilizálja a szerkezetet. A hidrofil cukor-foszfát gerinc kölcsönhat a sejt vízmolekuláival.

A DNS kettős spirál térkitöltő modellje Jól látszik, hogy a víztaszító bázisok szorosan egymásra fekszenek ami erősen stabilizálja a szerkezetet. A három dimenziós szerkezet jól szemlélteti az egymással ellentétes oldalon futó kis és a nagy barázdát. A DNS-kötő fehérjék csak a barázdákban kapcsolódhatnak a bázisokhoz. nagy árok kis árok

A DNS többféle másodlagos szerkezetet vehet fel Az élőlényekben és vizes oldatban a „B” forma a leggyakoribb, ebben a bázisok síkja majdnem merőleges a cukor-foszfát gerincre. Dehidrált körülmények között egy tömörebb „A” forma jön létre, melyben a bázisok síkja megdől. Hosszú GCGCGC.... ismétlődések a Z formát vehetik fel, amely balmenetes, zegzugos lefutású és megnyúlt. A B Z

A DNS replikációja

A replikáció problémái: 1., Sokszor: Egyetlen ember egyedfejlődése több millió sejtosztódást igényel. 2., Gyorsan: 1000 nukleotid/másodperc (1000 nukleotid/perc sebesség mellett egy E coli 106 bp méretű genomja 3 napig replikálódna!) 3., Pontosan: A genom másolásánál csupán 1/ 100 000 000 (10-8) replikációs hiba történik, melynek 99%-át a javító rendszer utólagosan kijavítja. Vagyis a 109 bp genom méretű emberi sejt átlagos osztódása során 0-1 új mutáció keletkezik replikációs hiba folytán.

A DNS replikáció jóslata A DNS kettős spirál szerkezetéből közvetlenül adódik a megkettőződés mikéntje. A bázis párosodás szigorú törvényéből az következik, hogy amennyiben a kettős spirál két szála zipzárként kettéválik, mindkét szál mintaként (templátként) szolgálhat egy új szál szintéziséhez, melynek során az eredeti szállal és egymással megegyező szerkezetek jönnek létre. Ezzel magyarázatot nyer a az örökítőanyag pontos átadódása a sejtosztódás során. A genetikai kódot a nukleotid sorrend adhatja.

A replikációs kezdőpont (origó). A replikációnak kitüntetett kezdőpontja (origója) van. Az E.coli egyetlen replikációs origója, az oriC, 245 nukleotidpár hosszú.

A DNS replikáció enzimei topoizomeráz

A replikáció pontossága A szintézis során 104-106 nukleotidonként történik egy hibás beépülés. Ez igen magas mutációs rátát eredményezne. A polimeráz III enzim saját hibajavító rendszerrel rendelkezik, és a hibás beépülések 99%-át azonnal kijavítja, így csak 108 nukleotidonként marad egy hiba. A replikáció utáni javítórendszer ennek 99%-át is kijavítja. Így adódik a végső pontosság, ami 1010 nukleotidonként egy hiba. (Ez az emberi genom esetén egyetlen hibát jelent egy replikáció során.)

Az eukarióta kromoszóma sok replikációs origót tartalmaz Egy diploid sejt 3H timidin beépülésének képe a szintézis fázis elején. Drosophila politén kromoszóma 3H timidin beépülésének képe a szintézis fázis elején. A radioaktív jelek replikációs origókat jelölnek.

Több vírus és episzóma „gördülő gyűrű” (rolling circle) módon replikálódik 1., Az egyik szál pontszerűen bevágódik (nick). 2., Az ép szálat templátként használva a polimeráz a törött szál 3’ végéhez új nukleotidokat épít körbe-körbe, miközben leszorítja az előtte lévő régi szálat. 3., A leszoruló egyes szál kettős szállá egészül ki. 4., A lineáris kettős szál méretre darabolódik és gyűrűkké zárul. 5’