Antigén (Rövid emlékeztető) (animált ábra) (Rövid emlékeztető) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál Antigén determinánsok avagy epitopok: az antigén azon részei amihez az antigén receptorok vagy az antigén specifikus ellenanyagok közvetlenül kötődnek Antigén

- Ellenanyagok Poliklonális ellenanyagválasz: + A szérumfehérjék globulin frakciójában különülnek el, ezért immuno-globulinoknak (Ig) nevezik őket. Az Ig-ok B sejt antigén receptorként (BCR) B-limfocitákon és a B-sejtekből differenciálódó plazmasejtek által termelt fehérjeként (ellenanyag) jelennek meg. Poliklonális ellenanyagválasz: - A klón szelekciós elv értelmében: mindig egy adott Ag-t felismerő (adott BCR-rel rendelkező) B-limfociták aktiválódnak, osztódnak és differenciálódnak plazmasejtekké. Ezen folyamatok a perifériás nyirokszervekben mennek végbe A plazmasejtek által termelt ellenanyagok a keringésbe kerülnek. Az összetett szerkezetű antigének által kiváltott humorális immunválasz során több B-limfocita klón aktiválódik. Ennek eredményeként poliklonális eredetű heterogén ellenanyag-keverék képződik, melyek az antigén különféle részeivel (epitopok v. Ag-determinánsok) reagálnak. Immunszérum Antigénnel kimerített szérum α1 α2 β y + - albumin globulinok Mobilitás Fehérje mennyiség

A POLIKLONÁLIS ELLENANYAG VÁLASZ Immunszérum B-sejt készlet Ag Ag Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok

Immunoszorbens Oszlop sepharose gyöngyök BSA

Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció

Nem kötődő fehérjék lemosása PBS Ha nem jön le több fehérje (pl. aspecifikus ellenanyag), a Coomassie festék barna marad. Coomassie Brillant Blue G250 festék

Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról 4-5 ml glicin-HCl pufferrel mosni Arról, hogy a farkciószedés közben és végén az oszlopról jön-e még le fehérje, egy-egy Coomassie Brillant Blue-t tartalmazó csőbe cseppentéssel győződhetünk meg TRIS-t tartalmazó csövekbe gyűjtjük 9-10 cseppenként a frakciókat, hogy a pH neutralizálódjon

Monoklonális ellenanyagokat a sejtkultúra folyadékból („felülúszóból”) Bakteriális protein A v. protein G oszlopokkal lehet hatékonyan tisztítani. Protein A, Protein G  az ellenanyagok Fc részét kötik meg (a baktérium így is védekezik az ellenanyagok általi felismerés ellen: lekötött Fc rész  nincs effektor funkció)

Monoklonális ellenanyagok előállítása Antigén specifikus ellenanyagokhoz legegyszerűbben immunizált élőlények szérumából juthatunk. Hosszú távon újabb és újabb immunizálást igényel. - Nehezen standardizálható - Limitált mennyiségben áll rendelkezésre (lásd a táblázatot hátrébb) Ha fel tudnánk szaporítani valamelyik B sejtet, ami „felismeri” az antigént (és az anigén valamelyik részéhez kötődő ellenanyagot termel), sokkal egyszerűbb volna a helyzet. Monoklonális ellenanyagok előállítása Georges J.F. Koehler és Cesar Milstein (Nobel díj 1984-ben)

Monoklonális ellenanyagok (animált ábra) Antigén Monoklonális ellenanyagok Poliklonális ellenanyagok

Monoklonális ellenanyagok egyetlen B-limfocita klón termékei homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus) előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben állíthatók elő - „in vivo” patológiás körülmények között is előfordulhat pl. mieloma multiplex esetében egy B sejt klón malignus szaporulata miatt nagy mennyiségű monoklonális ellenanyag lehet jelen („gammopátia” – rendelleneség a gamma globulin szérum frakcióban)

Monoklonális ellenanyag előállítás menete Vázlatosan egér/patkány beoltása antigénnel lép vagy nyirokcsomók izolálása, homogenizálása lépből származó plazmasejtek és B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/ mielóma sejtek) fúziója Az ellenanyag termelő klónok szelekciója/azonosítása A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatban feldúsul

Monoklonális ellenanyagok elöállítása A hibridóma technika lényege (Többféle módszer is létezik. A legjobban bejáratott, sejtfúzió alapú „hibridóma” módszert tekintjük át a következőkben) A hibridóma technika lényege számunkra értékes tulajdonsággal rendelkező, de korlátozott élettartamú immunsejt kiválasztható, és korlátlan ideig fenntartható, szaporítható. lényege, hogy aktivált immunsejteket fuzionáltatunk korlátlanul szaporodó tumorsejtekkel. A kapott hibridek közül számunkra azok értékesek, amelyek kromoszomálisan stabilak, rendelkeznek az adott immunsejt tulajdonságaival (ellenanyag- vagy faktortermelő* képesség) és korlátlanul szaporodnak. A megfelelő hibrid sejteket többlépéses szelekció végeredményeként, sejtklónok formájában kapjuk meg. (* pl. citokin termelő, T sejt hibridómák is létrehozhatóak)

Szelektív tápfolyadék érzékeny (animált ábra) Sejtfúzió lépsejt mielómasejt (SP2) Szelektív tápfolyadék érzékeny Napok alatt maguktól elpusztulnak Szaporodó sejtek Nem antigén specifikus ellenanyagot termelő, vagy ellenanyagot nem termelő hibridek Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek

Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny 1. szelekciós lépés Szaporodó sejtek lépsejt mielómasejt (SP2) HGPRT+ TK+ HGPRT- TK- Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny HGPRT+ TK+ HGPRT- TK- (animált ábra)

Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek 2. Szelekciós lépés: Az ellenanyag termelő sejtek kiválasztása (animált ábra) Nem antigén specifikus ellenanyagot termelő, vagy ellenanyagot nem termelő hibridek Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek Nincs jelen az antigénnel reagálni képes ellenanyag. Vannak a sejtkultúrában az antigénnel reagálni képes ellenanyagok. Eldobjuk Tovább tenyésztjük, klónozzuk.

(animált ábra) A klónozás célja A kapott hibridómák összessége még nem antigén specifikus, és poliklonális ellenanyag keveréket termel Antigén specifikus, de különféle antigén determinánsokat felismerő monoklonális ellenanyagokat termelő B sejt hibridóma klónok

A „HAT” szelekció biokémiája Hipoxantin, Aminopterin, Timidin tartalmú tápfolyadék prekurzor gátlószer A következő három ábra nem tartozik szorosan a témakörhöz, de segíti a megértését

”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok (animált ábra) A DNS szintézis két fő útja ”salvage” útvonal nukleinsav lebontási termékek felhasználása, purinok, hipoxantin, timin HGPRT, TK (hipoxantin guanin foszforibozil transzferáz, timidin kináz) nukleozid trifoszfátok DNS ”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok egyéb enzimek aminopterin HAT médium – Hipoxantin+Aminopterin+Timidin Az aminopterin az anyagcsere blokkoló. A hipoxantin és a timidin a salvage útvonal alapanyagai. ”de novo” útvonal

DNS ”salvage” útvonal HGPRT TK ”de novo” útvonal dGTP dTTP dTMP IMP Ez „ugyan az”, mint az előző ábra, csak részletetezve: ”salvage” útvonal purinok, pl. hipoxantin timidin HGPRT TK dGTP dTTP dTMP DNS IMP dCDP OMP dATP dCTP a szaggatott nyilak sok esetben nagyon sok apró lépést és köztesterméket takarnak dATP,dGTP,dTTP,dCTP – deoxi adenozin trifoszfát,…,…,… deoxi nukleozid trifoszfátok PRPP – foszforibozil pirofoszfát IMP – inozin monofoszfát OMP – orotidilát (orotidin monofoszfát?) HGPRT – hipoxantin-guanin foszforibozil transzferáz TK – timidin kináz aminopterin foszforibozil pirofoszfát, glutamin aszparaginsav, karbamoil foszfát ”de novo” útvonal IMP – inozin monofoszfát OMP – orotidin monofoszfát HGPRT – hipoxantin-guanin foszforibozil transzferáz TK – timidin kináz HAT  Hipoxantin, Aminopterin, Timidin

”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal Hogyan hozható létre a HGPRT-, TK- (defficiens) fúziós partner sejtvonal? ”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal HGPRT- és TK- fúziós partner sejtek szelektálhatóak Ezek a pirimidin és purin vegyületek a HGPRT+ vagy TK+ sejtek esetében osztódáskor a ”salvage” útvonalon az örökítőanyagba épülve a sejtek pusztulásához vezetnek, élve hagyva a HGPRT- TK- sejteket.

Monoklonális ellenenyagok felhasználási lehetőségei immundiagnosztika (tumordiagnosztika - tumor spec mEA-gal) Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása (differenciációs, aktivációs markerek) Immunhisztokémia Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével - Sejtek elválasztása (pozitív – negatív szelekció –FACS, Panning, vasszemcsék mágneses térben) CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) Komplex antigén keverékek analizálása Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin lymphomában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással Kovalensen kapcsolt, liposzómába zárt toxin Gyógyszer-eliminálás antitestekkel Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

A poliklonális és monoklonális ellenanyagok jellemzői Poliklonális ellenanyag Kis affinitású Monoklonális Ea. Nagy affinitású Monoklonális Ea. Felismert antigén determinánsok száma Több (gyakori keresztreakciók) Egy (de gyakori keresztreakciók) Legtöbbször egy Specificitás polispecifikus gyakran polispecifikus monospecifikus Affinitás kicsi-nagy (keverék) kicsi nagy Nem-spec. Immunglobulinok koncentrációja magas alacsony Hozam (koncentráció) Előállítási költség Standardizálhatóság nem, ill. nehézkes egyszerű Mennyiség limitált korlátlan Gyakorlati felhasználhatóság módszer függő gyenge kiváló

Újra klónozás limitált hígításos módszerrel (gyorsklónozás): a hibridóma sejteket megszámoljuk 96 lyukú szövettenyésztő lemezre lyukanként 100 l tápfolyadékot kimérünk, majd az első lyukába (A1) 1000-5000 sejtet 100 l-ben hozzáteszünk. Belőle felező hígításban a szövettenyésztő lemez-en lefelé, majd oldalirányban is hígítást végzünk: 100 l tápfolyadék/lyuk található a szövettenyésztő lemezen; Az első oszlopban a sejteket tartalmazó (A1-es) lyukból kivett 100ul sejtszuszpenziót hígítjuk lépésekben lefelé, majd az első oszlop lukait 200 l-re kiegészítjük. Ezután sokcsatornás pipettával hasonló módon sorozathígítást végzünk oldalirányban is) A szövettenyésztő lemez jobb alsó részén, így nagy valószínűséggel lesznek olyan lukak, amelyekbe csak 1 db sejt került. Felező hígítások 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B D E F G H C Felező hígítások

~ * 104