Az autoimmun kórképek laboratóriumi diagnosztikája I Az autoimmun kórképek laboratóriumi diagnosztikája I. Szisztémás autoimmun betegségek

Az autoimmun betegségekről általában Az immunrendszer saját antigénekkel szembeni toleranciája felborul, és a saját sejtekkel, szövetekkel szembeni (humorális és celluláris) immunreakció lép fel Megkülönböztetünk szisztémás (több szervet, vagy a szervezet egészét érintő), és szervspecifikus autoimmun betegségeket A szisztémás autoimmun betegségek diagnosztizálása nemzetközi konszenzuson alapuló kritériumrendszerek alapján történik A diagnosztikai kritériumok között laboratóriumi eltérések is vannak, mint pl. az adott kórképre jellemző autoantitest jelenléte Az autoantitest-kimutatás mellett a szisztémás autoimmun betegségek laboratóriumi diagnosztikájának és követésének egyéb módszerei: - Komplement-vizsgálatok (komplement-faktor szintek, komplement aktivitás) - Immunglobulin szint mérés - CRP, egyéb akut fázis proteinek - Hematológiai vizsgálatok, vérkép - Hemosztázis vizsgálatok (lupus anticoagulans) - Krioglobulin kimutatás és analízis stb.

Autoantitestek Fiziológiás autoantitestek Pathológiás autoantitestek   Fiziológiás autoantitestek Pathológiás autoantitestek - alacsony titer - magas titer - alacsony affinitás - magas affinitás - IgM izotípus - IgG izotípus - polireaktivitás - magas specificitás - fontos, konzervatív szerkezetű molekulák ellen irányulnak Szisztémás kórképek: Szervspecifikus kórképek: Általános sejt(mag)komponensek szerv- és szövetspecifikus antigének elleni autoantitestek elleni autoantitestek Pathogén antitestek Nem pathogén antitestek - antifoszfolipid, ANCA - anti-Sm, anti-Jo-1, stb anti-GBM, stb Kimutatásuk: ELISA vagy indirekt immunfluoreszcens (IIF) technikával (egyéb módszerek: blot, RIA, FIA, agglutinációs, precipitációs technikák)

A legfontosabb szisztémás autoimmun betegségek Szisztémás lupus erythematosus (SLE) Rheumatoid arthritis (RA) Sjögren szindróma (SS) Kevert kötőszöveti betegség (mixed connective tissue disease, MCTD) Szisztémás sclerosis (SSc), scleroderma Polymyositis/Dermatomyositis (PM/DM) Primer vasculitisek Antifoszfolipid szindróma

A poliszisztémás autoimmun kórképek legfontosabb autoantitestjei: Antinukleáris faktor (ANF) vagy „antinuclear antibody” (ANA): a sejtmag különböző komponensei ellen irányuló autoantitestek összefoglaló neve. Indirekt immunfluoreszcenciás szűrővizsgálat. Kettősszálú DNS (dsDNS) elleni antitest: az SLE egyik diagnosztikus kritériuma (homogén ANF magfluoreszcencia) Hiszton elleni ellenanyag: gyógyszer indukálta SLE ellenanyaga (homogén ANF magfluoreszcencia) Kromatin (nukleoszóma) elleni antitest: dszDNS + hiszton komplex ellen képződött ellenanyagok, jellemzőek lupus nephritisre Extrahálható nukleáris antigének (ENA) elleni antitestek, szemcsézett (granuláris) ANF magfluoreszcenciát mutatnak. Antigén komponenseik: SS-A (Ro), SS-B (La), Sm, U1RNP, Scl-70, Jo-1 nevű RNS-ből és nem hiszton természetű fehérjéből álló komplexek. Anti-neutrofil citoplazmatikus antitestek (ANCA) típusai: Citoplazma fluoreszcenciát mutató c-ANCA, perinukleáris fluoreszcenciát mutató p-ANCA és atípusos mag és citoplazmafluoreszcenciát mutató atípusos ANCA. 7. Antifoszfolipid antitestek típusai: anti-kardiolipin antitest anti- béta2glikoprotein1 antitest lupus antikoaguláns

Az autoantitestek kimutatásának jelentősége Diagnózis felállítása - marker autoantitestek (SLE:anti-dsDNS, anti-Sm; pSS: anti-SSA, SSB; MCTD: anti-U1RNP stb.) Differenciáldiagnózis Alcsoportba sorolás, prognózis előrejelzése (SSc: anti-centromer, anti-Scl70) Aktivitás megítélése, terápia nyomonkövetése (anti-dsDNS, anti-Jo1, ANCA)

ANA kimutatás Szűrőtesztek Indirekt immunfluoreszcencia patkányszövet (máj, vese, gyomor) HEp-2 sejt ELISA screen (HeLa, HEp-2 mag- vagy sejtkivonat, tisztított és/vagy humán rekombináns antigének)

Antinukleáris antitest (ANF, ANA) Gyűjtőfogalom: A sejtmag különböző komponensei ellen irányuló autoantitestek összefoglaló neve Kimutatásának standard módja: indirekt immunfluoreszcencia (IIF) Kimutatásához használt szubsztrát: - szervmetszet (rágcsáló máj, vese) - HEp-2 sejtek Rágcsáló szervmetszet HEp-2 sejtek (human epithelioma sejtvonal) nem humán antigén - humán antigén a metszés következtében a - ép sejtmagok, monolayerben sejtmagok roncsolódhatnak kisebb sejtmagok - nagy sejtmagok osztódó sejtek nincsenek - nagyszámú osztódó sejt kevesebb mintázat azonosítható - több mintázat azonosítható

Antinukleáris antitest májmetszeten: HEp-2 sejteken:

Antinukleáris antitest (ANF, ANA) kimutatás IIF technikával ANF kimutatás IIF technikával: szűrőmódszer, amely - az antitest specificitásának megállapítására csak egyes esetekben, - az antitest mennyiségének megállapítására csak a vizsgált szérum titrálása esetén alkalmas Ezért: ANF pozitivitás esetén további vizsgálatok szükségesek az antitest specificitásának megállapítására, és mennyiségi meghatározására

Autoantitest kimutatás indirekt immunfluoreszcens technikával Szubsztrát: sejt, szervmetszet tágylemezen Antigén-antitest komplex Ag-At. +2.antitest-FITC

A HEp-2 sejt sematikus felépítése

Leggyakoribb ANF mintázatok HEp-2 sejten Homogén Granuláris (finom / durva) (speckled) Nukleoláris Magmembrán* Centromer* Citoplazmatikus mintázatok: mitokondrium* Golgi készülék* citoszkeleton riboszóma mitotic spindle (oszlási orsó)* * Mintázat alapján azonosítható autoantitestek

Anti dsDNA antitest HEp-2 sejt SLE: Anti-dsDNS: 60-70 %, anti-hiszton: 40-60%. Anti-nukleoszóma:85-90%.

Anti-SS-A/Ro antitest pSS: anti-SSA:85-90 %, SLE:40-50%.

Anti-SS-B/La antitest pSs:anti-SSB: 70-75%, SLE: 20-25%.

Anti-Sm antitest SLE: 30-35%.

Anti-U1RNP antitest MCTD: >95%

Anti-Jo1 antitest PM/DM: 20-25%.

Anti-Scl-70 antitest PSS: 40-50%.

Anti centromer antitest PSS: 40-50 %.

Mitokondrium elleni antitest

Az indirekt immunfluoreszcens technika problémái A szubsztrát preparálása friss preparátum, +4°C-on 1 évig, -70°C-on néhány évig eltartható A detektáló antitest bárány, kecske vagy nyúl használható az immunizáláshoz A-P (affinity-purified) antitest a kívánatos A vizsgálandó minta higítása 1:5, 1:10, 1:20 – tovafutó hígítás A konjugátum/minta hígítása: PBS+Tween 20 vagy BSA/PBS Az indirekt immunfluoreszcens technika az esetek többségében az autoantitestek kimutatásának szűrőmódszereként alkalmazható, a további identifikálás ELISA technikát igényel!

IIF ANA vizsgálatok standardizálásának problémái Szubsztrátok különbözősége Szubsztrát fixálásának különbözősége Különböző szérumhígítások Konjugátumok (fluorokrómmal konjugált anti-human immunglobulin) különbözősége (faj, izotípus, fluorescein/protein arány) Fluoreszcens mikroszkópok különbözősége (érzékenység) Nem specifikus antitestek zavaró hatása Emberi tényező Referencia preparátumok: - Arthritis Foundation/CDC (USA) ANA Reference Sera (1-10) - WHO: W1064 anti-nuclear-factor (homogeneous) 66/233

Arthritis Foundation/CDC ANA Reference Sera Mintázat Antitest specificitás 1. Homogén ds-DNA 2. Granuláris (speckled) SS-B 3. Granuláris (speckled) SS-A, SS-B, RNP 4. Granuláris (speckled) RNP 5. Granuláris (speckled) Sm 6. Nukleoláris N/A 7. Granuláris (speckled) SS-A 8. Centromere N/A 9. Homogén Scl-70 10. ? Jo-1

Az indirekt immunfluoreszcens technika problémái I Szubsztrát, detektáló antitest kiválasztása Rágcsáló szövetmetszetek (patkány, egér) Az antigén nem humán, a kötődés gyenge Heterofil antitestek magas hátteret adnak

Az indirekt immunfluoreszcens technika problémái II Humán szövetmetszetek A beszerzés problematikus A detektáló antitest a humán szövethez kötődve magas hátteret ad

Az indirekt immunfluoreszcens technika problémái III Majom szövetmetszetek I A humán és majom immunglobolinok 98%-os azonossága A detektáló antitest a majomszövethez kötődik, magas hátteret ad

Az indirekt immunfluoreszcens technika problémái IV Majom szövetmetszetek II A detektáló antitest species specifikus, ezért csak a humán antitesthez kötődik

ANA kimutatás ELISA-val Antigén: - sejtmagkivonat - tisztított (állati eredetű) antigének elegye - rekombináns (humán) antigének elegye IIF ANA ELISA ELISA ELISA (sejmagkivonat) (tisztított ag) (rekombináns ag) Anti-dsDNA + (hom.) + + + Anti-Sm + (gran.) + + + Anti-fibrillarin + (nukleoláris) + - - Anti-mitokondr.+ (citoplazmatikus) - - - Az ANA ELISA tesztek nem standardizáltak! A klinikusnak tisztában kell lennie azzal, hogy a laboratórium milyen módszert alkalmaz ANA kimutatásra!

Autoantitest kimutatás ELISA-val 1. 2. 3. 4. Antigén Antigén – antitest komplex Antigén – antitest komplex + konjugátum (2.antitest) Antigén – antitest komplex + konjugátum + szubsztrát =színes termék A színreakció intenzitása arányos a mintában levő autoantitest mennyiségével

ELISA vizsgálat több pontos kalibrációval

A legfontosabb antinukleáris antitestek szisztémás autoimmun betegségekben SLE MCTD RA Sjögren PM/DM SSc dsDNA 60-80% - +- nukleoszóma 80-90% 30-40% Hiszton 30-50% Sm (Smith) 10-20% (U1)RNP 100% SS-A 40-50% SS-B 20-25% 70-75% centromer 20-30% Scl-70 Jo-1 Egyéb antinukleáris (és egyéb, nem sejtmag ellen irányuló) antitestek is előfordulnak szisztémás autoimmun betegségekben!

Autoantitest ELISA-k antinukleáris antitestek azonosítására Anti-dsDNA Anti-nukleoszóma Anti-hiszton Anti-SS-A Anti-SS-B Anti-Sm Anti-Sm/RNP Anti-Scl-70 Anti-Jo-1 ELISA vizsgálat jellegzetességei: - specifikus - mennyiségi meghatározást tesz lehetővé - automatizálható Anti-ENA

Autoantitest ELISA-k standardizálásának problémái Szilárd fázis (plate-ek) különbözősége Antigének különbözősége (tisztított, vagy rekombináns) Antigének koncentrációjának különbözősége Konjugátumok (második ellenanyagok) különbözősége, jelölés módja (HRPO, alkalikus foszfatáz) Szubsztrátok különbözősége Mértékegységek és referencia-tartományok különbözősége Referencia preparátumok WHO International Standard preparation - W1065 anti-dsDNA (Wo/80) WHO reference reagent - W 1063 anti-nuclear ribonucleoprotein (nRNP) autoantibody

ANA vizsgálat ajánlott algoritmusa ANA ELISA alkalmazása esetén ANA ELISA (antigén: sejtmagkivonat) Negatív Pozitív IIF ANA Antigén-specifikus ELISA-k

Autoantitestek, melyeknél a mennyiségi meghatározás klinikai információt hordoz (aktivitási markerek) Anti-dsDNA Anti-nukleoszóma/kromatin ANCA Autoantitestek, melyeknél a mennyiségi meghatározás nem informatív Anti-Sm Anti-Sm/RNP (U1RNP) Anti-SS-A, anti-SS-B Anti-centromer Anti-Scl-70

Köszönöm a figyelmüket!