AZ IMMUNOLÓGIAI LABORATÓRIUM DIAGNOSZTIKAI LEHETŐSÉGEI belgyógyászati szakvizsga előkészítő előadás http://rimm.dote.hu

Az Immunológiai Laboratórium feladata: A, Egy beteg immunrendszerének komplex vizsgálatával adatokat szolgáltatni egy immunológiai kórkép diagnózisának felállításához vagy kizárásához B, Az immunrendszer működésében kimutatott kóros laboratóriumi adat alapot szolgáltat a kórkép immunológiai eredetének felvetéséhez C, Ugyanakkor egy kóros laboratóriumi adat önmagában nem elegendő egy immunológiai kórkép diagnózisának kimondásához. A diagnózishoz mindig szükséges az összes klinikai adat együttes értelmezése

Az Immunológiai Laboratórium diagnózist segítő adatai: a.) Immundeficiencia esetén: - szerológia: IgG, IgA, IgM, IgE, C4 természetes ellenanyagok meghatározása, - fagocita vizsgálat: fagocitózis, kemotaxis, „killing”, kemilumineszcencia mérés, - limfocita alcsoportok vizsgálata sejtfelszíni antigének kimutatása alapján, - aktív immunizálás hatásának lemérése: pl.ellenanyag titer meghatározás Pneumococcus vakcináció után.  b.) Antimikróbális, reaktív gyulladások esetén (immunreaktivitás): -szerológia: We (fokozott), C reaktív protein, immunkomplex, IgG, IgA, IgM, IgE, C3, C4, szintek nőnek, -sejtes vizsgálatok: fehérvérsejtszám emelkedik, granulocitózis, limfocitózis, fagocita aktivitás megnő. -T sejtes aktiváció: HLA-DR, CD25, CD30, CD38, CD54RO, CD69 expresszió megnő.

2. Az Immunológiai Laboratórium adatai a terápia követésében c.) Allergia esetén: -szerológai: össz IgE, allergén specifikus IgE szintek emelkednek. -sejtek: az allergén T sejt proliferációt indukál.   d.) Autoimmun kórképekben:   -szerológia: a. szervspecifikus kórképekben szervspecifikus ellenanyagok, b. poliszisztémás kórképekben: „marker” ellenanyagok mutathatók ki. 2. Az Immunológiai Laboratórium adatai a terápia követésében a.) immunszuppresszió követése: ellenanyag szint mérésekkel b.) immunreaktivitás mérése: sejtproliferáció mérés citokin termelés mérés in vitro aktív immunizálás hatásának mérése c.) deszenzibizálás hatásának mérése allergiában, d.) immunszubsztitúció hatásának mérése: pl. IVIG terápia után

SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI I. A humorális immunitás vizsgálata: a, immunglobulinok b, akut fázis fehérjék c, komplement rendszer   a, Immunglobulinok vizsgálata: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE meghatározás - a normális szintek életkor függőek! - kórosan alacsonyabb szint: 1. Veleszületett deficienciák gyanúja: szelektív IgA hiány IgG alosztály deficiencia hiper-IgE szindróma 2. Szerzett deficienciák:         immunszuppresszív és citosztatikus gyógyszerek       malignus hematológiai megbetegedések         tumorok, senyvesztő betegségek         fokozott fehérjevesztés  - kórosan magasabb szint: infekció, autoimmun betegség, lymphoma - monoklonális immunglobulinok kimutatása - természetes ellenanyagok vizsgálata

SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI II. b, Akut fázis fehérjék vizsgálata: Akut fázis fehérjék: a vérben normálisan is jelenlévő proteinek, amelyek mennyisége az akut fázis reakció során jelentősen megnő (pozitív akut fázis fehérjék) vagy lecsökken (negatív akut fázis fehérjék)   Akut fázis reakció történik: infekció, autoimmun gyulladás, tumoros megbetegedés, szövetkárosodás: műtét, trauma, égés, szívinfarktus esetén -Pozitív akut fázis fehérjék: C-reaktív protein (CRP) alfa1-antitripszin haptoglobin fibrinogén komplement-komponensek szérum Amiloid A (SAA) prokalcitonin -Negatív akut fázis fehérjék: albumin, prealbumin transzferrin

Akut fázis proteinek (CRP) diagnosztikus jelentősége: -infekciók monitorizálása -autoimmun gyulladások aktivitásának megítélése (RA) -műtét után sebgyógyulás nyomonkövetése (sebfertőzés) -szervtranszplantációnál rejekció diagnosztizálása -coronaria betegeknél a fokozott rizikó előrejelzése -neonatológa  

SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI III. c, A komplement rendszer vizsgálata   Komplement rendszer: a szervezet kórokozókkal szembeni nem specifikus védekezésének első vonala  Funkcói: -kórokozók direkt károsítása (lízise) -kórokozók fagocitózisának elősegítése (opszonizáció) -a szervezetben képződő immunkomplexek eltávolítása - gyulladásos reakciók kiváltása Csökkent komplement szint esetei: - veleszületett deficiencia - csökkent termelés (májkárodosás) -aktív szisztémás autoimmun betegségben fokozott felhasználódás (SLE) Emelkedett komplement szint esetei: - akut fázis reakciók A komplement rendszer Funkció: - a kórokozók direkt lízise - opszonizáció - immunkomplexek eltávolítása - gyulladásos reakció kiváltása

A komplement rendszer aktiválódásának útjai: 1. Klasszikus út: antigén-antitest komplex útján 2. Alternatív út: baktériumok sejtfala vagy endotoxinja által gombák, vírusok, paraziták által 3. Lektin út: mannóz-kötő fehérje által   A komplement rendszer vizsgálatának laboratóriumi módszerei: a, Egyes komplement fehérjék mennyiségének mérése: C3, C4, C1INH b, Komplement rendszer aktivitásának meghatározása: CH50 meghatározás c, A komplement aktiváció termékeinek: C3a, C5a CH50 = a beteg 1ml szérumának annyiad része, amely 1ml 2%-os szenzibilizált birka vörösvérsejt szuszpenzió 50%-os hemolízisét hozza létre. Magas CH50 érték: nagy komplement aktivitást jelent Alacsony CH50 érték: csökkent komplement aktivitást jelent

SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI IV. Az autoantitestek vizsgálata   Fiziológiás autoantitestek jellemzői Pathológiás autoantitestek jellemzői   - alacsony titer - magas titer - alacsony affinitás - magas affinitás - IgM izotípus - IgG izotípus Vizsgálni kell: izotípust mennyiséget fennállás tartósságát Kimutatásuk: ELISA vagy indirekt immunfluoreszcens technikával

A poliszisztémás autoimmun kórképek legfontosabb autoantitestjei: Antinukleáris faktor (ANF) vagy „antinuclear antibody” (ANA): a sejtmag különböző komponensei ellen irányuló autoantitestek összefoglaló neve. Indirekt immunfluoreszcenciás szűrővizsgálat. Kettősszálú, duplaszálú DNS (dszDNS) elleni antitest: az SLE egyik diagnosztikus kritériuma (homogén ANF magfluoreszcencia) Hiszton elleni ellenanyag: gyógyszer indukálta SLE ellenanyaga (homogén ANF magfluoreszcencia) Kromatin (nukleoszóma) elleni antitest: anti dszDNS + hiszton komplex ellen képződött ellenanyagok, jellemzőek lupus nephritisre Extrahálható nukleáris antigének (ENA) elleni antitestek, szemcsézett (granuláris) ANF magfluoreszcenciát mutatnak. Antigén komponenseik: SS-A (Ro), SS-B (La), Sm, U1RNP, Scl-70, Jo-1 nevű RNS-ből és nem hiszton természetű fehérjéből álló komplexek. Anti-neutrofil citoplazmatikus antitestek (ANCA) típusai: Citoplazma fluoreszcenciát mutató c-ANCA, perinukleáris fluoreszcenciát mutató p-ANCA és atípusos mag és citoplazmafluoreszcenciát mutató atípusos ANCA. 7. Antifoszfolipid antitestek típusai: anti-kardiolipin antitest anti- béta2glikoprotein1 antitest lupus antikoaguláns

SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI V. Autoantitestek kimutatásának jelentősége:  I.Diagnózis felállítása – marker autoantitestek -anti-dsz DNS -szisztémás lupus erythematosus (SLE) -anti-Sm -szisztémás lupus erythematosus (SLE) -anti-hiszton - gyógyszer indukálta SLE -anti-SS-A -Sjögren szindróma, SLE -anti-Scl-70 -progresszív szisztémás sclerosis (PSS) -anti-Jo-1 -polymyositis/dermatomyositis (PM/DM) -anti-U1RNP -kevert kötőszöveti betegség (MCTD) -anti-Scl-70 -szisztémás sclerosis -anti-centromer -szisztémás sclerosis -reumatoid faktor -rheumatoid arthritis -anti-ciklikus citrullinált peptid -rheumatoid arthritis -anti-mutált citrullinált vimentin -rheumatoid arthritis -ANCA -vasculitis  2.Differenciáldiagnosztika 3.Alcsoportba, altípusba sorolás, prognózis előrejelzés -anti-Scl-70: PSS súlyosabb, rosszabb prognózisú formája -anti-centromer: PSS enyhébb, jobb prognózisú formája(CREST szindróma) -antifoszfolipid antitestek: antifoszfolipid szindróma  4.A betegség aktivitásának nyomon követése, terápia hatékonyságának megítélése: anti-dsz DNS, anti-Jo-1, antifoszfolipid autoantitestek, ANCA anti-TG(tireoglobulin), anti-TPO(tireoidea peroxidáz), anti-GBM (glomeruláris bazálmembrán) SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI V.  

SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI VI. Szervspecifikus autoantitestek -         pajzsmirigy elleni autoantitestek: anti-TG, anti-TPO: Hashimoto thyreoiditis, anti-TSH receptor: Graves-Basedov -         gyomor parietális sejt elleni autoantitestek: anaemia perniciosa -         pankreas szigetsejt elleni autoantitestek: I. típusú diabetes -         mellékvesekéreg steroidtermelő sejtjei elleni autoantitestek: Addison-kór -         veseglomerulusok bazálmembránjai elleni autoantitestek: Goodpasture szindróma -         simaizom elleni autoantitestek: autoimmun hepatitis -         LKM (máj-vese mikroszóma) elleni autoantitest: autoimmun hepatitis  

A poliszisztémás autoimmun betegségek marker autoantitestjei és előfordulásuk gyakorisága (%) SLE MCTD RA pSs PM/DM PSS ANCA vasculitis Anti-dszDNS* 60-70% 20/25% Anti-hiszton* 40-60% 20-25% Anti-nukleoszóma (kromatin)* 85-90% Anti-Sm* 30-35% 5-10% 10-15% Anti-(U1) RNP* >95% - Anti-SS-A* 40-50% Anti-SS-B* 70-75% Anti-centromer* Anti-fibrillarin* (U3 RNP) 25-30% Anti-RNS polimeráz I* Anti-Scl-70* Anti-Jo-1*x Anti-alfa-fodrin 35-40% Rf +- Anti-ciklikus citrullinált peptid (CCP) + anti-mutált citrullinált vimentin (MCV) ANCA 15-20% Anti-foszfolipid 20-30% *ANF (ANA) pozitivitás autoantitestje x citoplazma pozitivitást is mutat

SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK TÍPUSAI VII. Allergiás megbetegedések diagnosztikája   -össz IgE szint – nem feltétlenül emelkedett -allergénspecifikus IgE meghatározása (IgG ellenanyag = nem allergia) -allergénspecifikus IgE mennyiségi meghatározása, követése deszenzibilizáló kezelés során A laboratóriumi lelet önmagában nem diagnosztikus értékű!

SEJTES VIZSGÁLATOK TÍPUSAI I. Fagocita aktivitás mérés módszerei 1. mikroba kivonattal aktivált fagociták szabadgyök képzésének (kemilumineszcenciájának mérése luminométerrel)  2. monocita-, granulocita-fagocitózis mérés (fénymikroszkópos értékelés) Fc receptorok komplement –receptorok szénhidrát receptorok aktivitásának mérése lehetséges 3. Kemotaxis mérés   Limfocita proliferáció (blasztos transzformáció) mérés: Aktiválás: a.) specifikus antigénnel b.) aspecifikus mitogénel Értékelés: 3H-timidin inkorporáció alapján NK (természetes ölő) sejt aktivitás mérés: 51Cr jelzett tumorsejtekből történő izotóp felszabadítás alapján

SEJTES VIZSGÁLATOK TÍPUSAI II.  Limfocita CD antigének vizsgálata áramlási sejtfluoriméterrel: ezek sejtfelszíni differenciálódási antigének: limfocita-szubpopulációk: CD3+: T sejtek CD4+: helper T sejtek CD8+: citotoxikus T sejtek CD19+: B sejtek CD56+: NK sejtek A vizsgálatok célja: 1. Veleszületett defektusok kimutatása Szerzett defektusok kimutatása: -immunszupresszív és citosztatikus gyógyszerek -malignus hematológiai megbetegedések -tumorok, senyvesztő betegségek -AIDS következménye

Az áramlási sejtfluorimetria további felhasználása leukémia/limfoma diagnosztika (pl.: CD5/CD20 – B- CLL) sejtaktiváció mérés pl.: CD3/CD69, CD3/HLA-DR DNS tartalom meghatározás: tumorsejtek (46-nál több vagy kevesebb kromoszóma ill. DNS) Fagocitózis NK aktivitás Szabadgyök képzés Intracelluláris citokinek meghatározása Celluláris- Ca2+-szint, membránpotenciál, pH, stb… mérés

AZ IMMUNOLÓGIAI LABORATÓRIUMBAN ALKALMAZOTT VIZSGÁLÓMÓDSZEREK TÍPUSAI

SZEROLÓGIAI VIZSGÁLATOK:   1. FEHÉRJÉK MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA SZÉRUMBAN, PLAZMÁBAN, VIZELETBEN, LIQUORBAN -         radiális immundiffúzió (Mancini-technika) -         turbidimetria -         nefelometria -         elektroforézis 2. ÖSSZKOMPLEMENT AKTIVITÁS - hemolitikus módszer 3. PASSZÍV HEMAGGLUTINÁCIÓ - baktérium elleni antitest titer - rheumatoid faktor meghatározása 4. INDIREKT IMMUNFLUORESZCENCIA -         antinukleáris antitest kimutatása -         szervspecifikus autoantitestek -         ANCA (anti neutrophil cytoplasmaticus antitest) 5. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) -         autoantitestek pontos, kvantitatív meghatározása - allergén specifikus IgE

Mancini teszt

Immunglobulinok mérési technikái A. Turbidimetria B. Nefelometria Turbidimetria A koncentrációval arányos fényintenzitás csökkenését méri Nefelometria A koncentrációval arányos szórt fény intenzitását méri

az életkor függvényében Az immunglobulinok mennyiségének változása az életkor függvényében Immunglobulinok mennyisége IgG IgA IgM életkor

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 a1 globulins Albumin b1b2 globulins a2 globulins g globulins Albumin a2 globulins 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

PROTEINOGRAM OCT 18 93 2/1 ECH: 1 AGE: 0 SEX: TOTAL PROTEINS: 61.0 G/L A/G: 1.33 NAME 0/0 G/L NORM:% G/L Albumin 57.1 34.9 52-65 34-42 Alpha 1 3.6 2.2 2-4.5 1-3 Alpha 2 14.6 8.9 10-15 6-9 Beta 12.5 7.6 6-13 4-9 Gamma 12.2 7.4 10-19 6-13 N Albumin Albumin a1 zone: a1 antitrypsin, orosomucoid, a1 antichymotrypsin a2 zone: haptoglobin, ceruleoplasmin, Gc globulin, a2 macroglobulin, a lipoprotein b1 zone: transferrin – hemopexin b2 zone: blipoprotein, C3 complement g zone: IgG, IgA, IgM, (IgD, IgE)

with b mercaptoethanol reduction: correct typing of IgM K cryoglobulin with b mercaptoethanol reduction: correct typing of IgM K cryoglobulin. (To be confirmed after isolation of the cryoprecipitate). ELP G A M K L

ELP G A M K L

Image of biclonal gammapathy ELP GAM K L K L free free Image of biclonal gammapathy Presence of two Lambda monoclonal bands confirmed: l one with anti heavy chains (g, a or m) l the other, more anodic, with anti Lambda free light chain. Conclusion: presence of a Lambda Ig monoclonal component with more anodic Lambda free light chains.

Ur Ser Albumin

Ur Ser IgG Transferrin Albumin

Ur Ser Albumin

CH50 meghatározás (hemolízis)

passzív hemagglutináció (Waaler-Rose)

C-ANCA

P-ANCA

Atípusos-ANCA

Antigén Antigén – antitest komplex Antigén – antitest komplex + konjugátum Antigén – antitest komplex + konjugátum + szubsztrát = termék

ELISA (anti-kardiolipin IgG)

Kombinált ELISA (anti-Sm, anti-RNP)

Allergen specifikus IgE

SEJTES VIZSGÁLATOK   1 Fagocitasejtek szabadgyöktermelésének vizsgálata: teljes vér kemilumineszcencia 2. Monociták és granulociták fagocitálóképességének vizsgálata 3. limfocita blasztos transzformáció vizsgálata 4. NK sejt aktivitás mérés 5. Sejtfelszíni differenciálódási antigének (CD antigének) expressziójának vizsgálata áramlási citométerrel

Fluoreszkáló részecskéket fagocitáló neutrofil granulociták

Limfocita blasztos transzformáció Limfocita aktiválás (blasztos átalakítás) specifikus antigénnel aspecifikus mitogénnel T sejt mitogén: concavalin A (ConA), phytohemagglutinin (PHA) B sejt mitogén: lipopolysaccharid (LPS) T-B sejt mitogén: pokeweed mitogén (PWM) Aktiváció (blasztképződés) mérés: 3H-timidin felvétel alapján Értékelés: Proliferációs Index

NK sejt aktivitás mérés Célsejt: 51Cr –al jelzett K562 tumorsejtvonal Effektor sejt:a beteg limfocita szuszpenziója Értékelés: a.) 51Cr felszabadulás a beteg sejtei által b.) 51Cr felszabadulás az egészséges kontroll sejtei által c.) a két eredmény összevetése

Fehérvérsejt szubpopulációk eloszlása a sejtek nagysága és granuláltsága alapján limfocita granulocita Referens egyén monocita Limfocita túlsúly Törmelékes minta

CD3/CD19 pozitív sejtek meghatározása különböző festékkel konjugáltatott monoklonális ellenanyagok segítségével CD19+ sejtek CD3+ sejtek

CD4 és CD8 sejtek meghatározása különböző színű festékkel konjugáltatott ellenanyagok segítségével

Aktivált T-sejtek (kettős pozitív sejtek) meghatározása CD3+/HLADR+ sejtek

CD20/CD5 kettős pozitív sejtek meghatározása Referens egyén B-CLL-ben szenvedő beteg esetén CD20/CD5 kettős pozitív sejtek megjelenése