Biodegradációs, bioremediációs eljárások bemutatása II. RÉSZ FEHÉRJE- és SZÉNHIDRÁTPOLIMEREK

Fehérjék és bontásuk Fontosabb fehérjék: albuminok (szérumalbumin, ovalbumin, laktalbumin) globulinok (szérumglobulin, fibrinogén, aktin, miozin) prolaminok, glutelinek (gliadin) hisztonok, protaminok szkleroproteinek (fibroin, kollagén, keratin) összetett fehérjék: foszfo-, kromo-, gliko-, lipo-, nukleoproteinek

Fehérje, mint hulladék Élelmiszer ipar fejlődésének eredményeként Nem toxikus, de magas szervesanyag tartalma miatt veszélyes hulladéknak minősül Ált. nem hosszútávú probléma, kivétel vízben nem oldódó polimer formái, főleg keratin Naponta nagy mennyiségben keletk. Keratin alapú hulladék (toll, szőr) Kémiai megsemmisítés: savas hidrolizis Biológiai megsemmisítés keratináz enzimmel Potenciális szerves tápanyag (biomassza) takarmányokba, fermentációs alapanyagként érdemes hasznosítani

Toll, szőr A testsúly 5-7%-át is elérő mennyiségben jelenlévő, védő funkciót ellátó képletek szerkezetüknek stabilnak, ellenállónak kell lennie Biotechnológiai szempontból érdekesek és fontosak, mivel potenciális tápanyagok, hiszen fehérje polimerek - keratin -, így aminosavak építik fel Hátrányuk, hogy nehezen emészthetők, valamint minimális mennyiségben van jelen bennük néhány esszenciális aminosav pl.: metionin, lizin, hisztidin és triptofán Az aminosav összetétel változik az állat korával

Keratin szerkezeti felépítése Vízben oldhatatlan fehérje, ellenálló a legtöbb proteo-litikus (keratinolitikus) enzim aktivitással szemben A kiemelkedő haj/szőr rostok a kortikális sejtekből állnak, melyeket a kb. 10 nm-es keratin filamentek és az azokhoz kapcsolódó mátrix tölt ki. A keratint felépítő fehérjék csoportosítása: glicin-tirozin gazdag fehérjék (főleg a filamentek közötti mátrixban) alacsony kéntartalmú fehérjék (filamenteket alkotják) magas kéntartalmú fehérjék (mátrixban) A fehérjékből felépülő filamentumok között, a nagyszámú cisztein aminosavaknak köszönhetően kénhidak jönnek létre. A polipeptidek között kialakuló hidrogén kötések és hidrofób kölcsönhatások, valamint a szupercsavart szerkezet stabilitása felelős a nagyfokú rezisztanciáért.

Hidrogén kötés Diszulfid híd Ionos kötés Hidrofób- és van der Waals kölcsönhatások Polipeptid váz

KERATIN BONTÁSA MIKROORGANIZMUSOKKAL A mikrobiális lebontó folyamat lassú a természetben A nagy kéntartalom következtében csak kevés mikroorganizmus képes a keratin alapú hulladékokat hasznosítani – dermatofita gombák képesek szén- és nitrogénforrásként hasznosítani. Azóta számos mikroorganizmust azonosítottak, melyek hasznosítják a keratint: szaprofita- ill. parazita gombák, sugárgombák, baktériumok Az iparban nagy mennyiségben keletkező keratin alapú hulladék gyors eltávolítására van szükség A fehérjék egyik leggyakoribb, és legfontosabb enzimatikus módosítása a peptidkötések proteolitikus hasítása PROTEÁZOK

Poliszaharidok

Általános jellemzésük Poliszaharidok vagy glükánok sok monoszaharid egységből felépülő óriás molekulák Vízben nem oldódnak, vagy ha igen oldatuk kolloid tulajdonságokat mutat A legelterjedtebb természetes eredetű szénvegyületek Állatok, növények, mikroorganizmusok sejtjeiben különféle szerkezetű poliszaharidok, funkciójuk szerint váz-, tartaléktápanyag szénhidrátok

Keményítő A keményítő – poliszaharid növényi tápanyagraktár felépítése: D-glükóz - a(1 4) kötés - lineáris homopolimer (amilóz) és - elágazó homopolimer (amilopektin) keverék - hidrogénkötések erősítik a polimert - Az amilopektin elágazásainak mértéke és az amilóz : amilopektin arány a keményítő „korától” és származásától függ vízben oldódva kolloidális oldatot képez, s így enzimatikusan bontható Ipari alkalmazás: élelmiszer- és szeszipar (fruktóz-, glükóz ill. alkohol gyártás) Keményítőt hasító enzimek: α-amiláz, glükoamiláz, glükóz izomeráz

Amilázok a-amiláz (α-1,4-D-glükán-glükonohidroláz): Endoenzim, véletlenszerűen hasítja a polimert, oligoszaharidok keletk., a hosszabb láncokat könnyebben bontja extracellulárisan fejti ki hatását, termék gátlás (glükóz) Ca igény Hasznosítása: alkohol termelés, keményítő bontás Termelő fajok: Aspergillus niger, Bacillus subtilis, B. licheniformis, de megtalálható a nyálban, hasnyálmirigy is termeli, növényekben is A kül. eredetű enzimek sok tul-ban hasonlóak, de el is térnek egymástól (pH, hőm. opt) b-amiláz: nem redukáló láncvégekről hasít le maltózt Stabilabb, nincs Ca igénye Egyes Streptomyces, Pseudomonas fajokban, növényekben Glükoamiláz: elágazásoknál hasít, de mindhárom féle hasítrásra képes Termelő fajok: Aspergillus niger Pullulanáz (izoamiláz): amilopektin elágazódásainál, az a-1,6-kötéseit hasítja Termelő fajok: Pullularia pullulans

A keményítő szerkezete, és enzimatikus hasítása a-amiláz először oligoszaharidokra bontja (dextrinek) b-amiláz a láncvégi nem redukáló csoportoknál hasít le maltóz molekulákat

A fruktóz és alkohol ipari előállítása keményítőből Őrölt gabona keményítőjét gőz és nyomás segítségével gélesítik Lehűtik 50-60°C-ra és α-amilázt adnak hozzá, mely az α-1,4-kötéseket elhasítja rövidebb poliszaharid szálak Glükóz felszabadítása glükoamiláz enzimmel végtermék: glükóz Glükóz izomeráz hozzáadásával fruktózt állíthatunk elő Élesztő sejtek hozzáadásával a glükózból alkohol fermentálható α-amilázt főleg Bacillus-ok termelik, extracelluláris Glükoamiláz termelő pl. Aspergillus niger

Ciklodextrinek A keményítő amilóz komponenséből képezhető gyűrűs oligoszaharidok (B. macerans glükozil transzferáz) Szerkezetüknek köszönhetően „molekuláris csomagolóanyagként” hasznosíthatók gyógyszeripar-, de mezőgazdaság-, élelmiszeriparban is Biodegradáció szempontjából a jelentősége az, hogy bizonyos anyagok hozzáférhetőségét javítja, nehezen oldódó vegyületeket kolloidális állapotba juttatva bonthatókká válhatnak

Glikogén Dextránok Emberi, állati eredetű tartalék tápanyag Szerkezete hasonló a keményítőhöz Biodegradációs szempontból szerepe élettanilag nagy, de hasznosítás, ipari alkalmazás szempontjából nem jelentős Dextránok Jellegzetes baktérium eredetű un. tokanyag poliszaharidok Szerkezetére a D-glükóz részek a(1 6) kötése jellemző, néhol láncelágazódást is megfigyeltek Mesterségesen térhálósított alakja a Sephadex Biodegradáció szempontjából nem jelentősek

Glikolipidek (lipopoliszaharidok), glikoproteinek Sejteket határoló membránokban Jelentőségük a biodegradációs eljárásokban jelentős lehet, mint felületaktív anyagok Néhány mikroorganizmus képes az extracelluláris terébe kijuttatni e molekulákat, melyek a vízben nem, vagy rosszul oldódó anyagokkal micellákat képezve a szerves tápanyagokat hozzáférhetővé teszik a mikroorganizmusok számára

Cellulóz a legelterjedtebb polimer molekula a bioszférában (a növények sz.súlyának 30-35%-a) hosszú lánca D-glükóz molekulák β-1,4-es kapcsolatából épül fel a cellulózban a glükóz láncok úgy helyezkednek el, hogy egy kristályszerű szerkezetet tudnak létrehozni, ami vízhatlan oldhatatlan, és ellenáll a hidrolízisnek a növényekben támasztó-szerkezeti molekula (lignocellulóz) a legegyszerűbb komponens a lignocellulózban Hidrogén hidak is kialakulnak

Cellulóz Hasznos szénforrás, ezért iparilag hasznosítani kellene Első lépés: ki kell hámozni a lignin-hemicellulóz takaróból, ezek után jöhetnek a cellulázok: - endoglükanáz - exoglükanáz - cellobiohidroláz - β-glükozidáz, v. cellobiáz Biogáz, bioetanol ellőállításban egyre nagyobb szerep!

cellulázok Enzimrendszer: endo-, exocellulázok, b-glükozidázok Extracelluláris, ill. sejtek felszínén Termelő fajok: Trichoderma, Aspergillus, Penicillium, Clostridium, Cellulomonas fajok Endocelluláz: random hasít oligomerekre Exocelluláz: láncvégről dimereket – cellobióz- hasít b-glükozidáz: cellobiózt kettéhasítja glükózokra

Cellulóz és hasító enzimei

Cellulóz bontó mikroorganizmusok Széles körben elterjedt e képesség a baktériumok és eukarióta gombák körében 1970-es évek: olajválság megújuló energiaforrások kutatása (cellulózból etanol és más hasznos vegyület előállítása) Pl. Trichoderma gombák - egyedi enzimek dolgoznak egymással szinergizmusban (aeroboknál általában igaz) - Trichoderma reesei termofil Clostridiumok (Gram pozitív, obligát anaerob bakt.) - C. thermocellum, C. cellulolyticus Kevés kivétellel az anaerob bakt. un. policelluloszóma organellunokba szervezik celluláz enzimeiket

Celluloszóma sok van a sejt felszínén és extracellulárisan is nagy molekula, kb. 2000 kDa, extracellulárisan rakódik össze extracelluláris szupramolekuláris komplex, ami hatékonyan bontja a cellulózt és más sejtfalkomponenseket (glikozidos kötéseket) nagy celluláz-aktivitás az enzimösszetételt valószínűleg a szubsztrát is befolyásolja a csapatmunka hatásosabb: kevesebb enzim elég ugyanannyi kristályos cellulóz szolubilizálásához (szinergizmus), míg a szabad enzimek könnyebben eldiffundálhatnak a C. thermocellum (celluloszóma) hatékonyabb a Trichoderma reeseinél (egyedi enzimek) mesterséges celluloszómák: mesterséges polimerek lebontása (nejlon, poliészter, műanyagok), válogatott enzimek meghatározott helyre beépítve

Nem celluloszómás cellulázok A termelő fajok gyakran több hasonló funkciójú cellulázt termelnek, melyek specifitása némileg eltér (a polimert más-más helyen hasítják) Pl. T. reesei két exoglükanáz, 5 endoglükanáz. Cellulomonas sp. 6 endoglükanáz Ezek az enzimek rendelkeznek cellulóz kötő doménnel Thermobifida fusca faj érdekessége, hogy van egy olyan glükanáza, mely endo-, és exo aktivitással is bír

Hasznosítás Papírgyártás, biogáz, bioetanol előállítás Növényi eredetű hulladék nagy mennyiségben keletk. a növények feldolgozása során Nem tisztán cellulóz, hanem lignocellulóz formájában: A lignin, hemicellulóz, cellulóz polimerek különböző kombinációja (növények szerkezeti felépítésében alapvető)

Lignocellulóz alkotó komponensei Lignin: 3D, globuláris, szabálytalan, nem oldható, nagy molek.s. polimer fenilpropán alegységek- különböző kémiai kötésekkel kapcs. kémiai kötésekkel kapcsolódik a hemicellulózhoz is, és a cellulóz szálakat beburkolja felelős a növény rigiditásáért, a mechanikai behatásokkal és mikroorganizmus támadásokkal szembeni ellenállóképességért Hemicellulózok: rövid láncú, heterogén polimerek - hexózokat (pl. glükóz, mannóz, galaktóz), pentózokat (xilóz, arabinóz) tartalmaznak három fő csoport: a, xilánok b, mannánok c, arabinogalaktánok

Reprezentatív lignin szerkezet a fenilpropán egységek CH C 2 Reprezentatív lignin szerkezet a fenilpropán egységek kapcsolódása nem szervezett, nem ismétlődő

Reprezentatív xilán szerkezet, és hasító enzimei Xilán az egyik leggyakoribb poliszaharid a term-ben, a cellulóz és lignin szálak között kovalens ill. hidrogén kötésekkel kapcs. Papíripar számára hátrány

Etanol előállítás lignocellulózból

Kitin Rovarok, rákok-ban váz poliszaharid, megtalálható gomba sejtfalban Vízben, híg savban, lúgban nem oldódik Tömény savval is csak nehezen hidrolizálható melegítéssel N-acetil-glükózamin, majd ecetsav és D-glükóz keletkezik Felépítése: N-acetil-D-glükózamin részek b-glikozid (1-4) kötéssel kapcsolódnak Enzimes hasítása kitinázzal, mely egyes baktériumokban, gombákban, néhány növényben fordul elő Derivátja a kitozán Kitin szerkezeti részlet

Pektinek Növényekben, főleg gyümölcsökben (citrus félék, alma, szeder, ribizli –ben sok), savas karakterű Legjellemzőbb a poligalakturonsav előfordulása, melyben a D-galakturonsav részek a(1 4) kötéssel kapcsolódnak, ezt a kötést pektináz enzimmel lehet hasítani Minor komponensként rhamnóz előfordul a(1 2) kötéssel, valamint neutrális cukrok, pl. arabinóz, galaktóz, xilóz, a galaktironsav metilált lehet Iparban gélesítő ágens (pl dzsem készítéshez) Pektináz jelentősége: élelmiszeripari hasznosítás (gyümölcslé) Sejtfal szerkezet

Elágazások lehetnek a pektinben COOH OH Poligalakturonsav részlet Elágazások lehetnek a pektinben

Pektin gélesedése Ca ionok hatására Poligalakturonát

Lipidek Elterjedtek: növényekben a magvak súlyának akár 50%-a, állatvilágban pl. méhek viasz termelése, tengeri élőlények túléléshez fontos a zsiradék Lúgokkal kezelhetjük, de biológiai bontása enzimatikusan észterázok, lipázok Bontás eredménye glicerin és zsírsav Hulladékként a szennyvizek elvezető csatornáiban komoly gondot okoznak, eltömődések, ill. gátolják az oxigén transzfert Biodegradációt gátolja, hogy nem oldódnak vízben, így biohozzáférés korlátozott Biodegr elősegítése pl. felületaktíva. v. oldószer adagolás

Észterázok, lipázok Észterkötések hidrolizise: glicerinészterekből zsírsav és glicerid Extracelluláris, ált. gyengén lúgos környezetben, Ca ionok pozitív hatás (zsírsavak Ca sóként kicsapódnak, nincs termékgátlás) Indukálhatóak, az enzim termelésre a N forrás is hatással van 3 féle mikrobiális lipáz: 1. nem specifikus, 2. régióspecifikus, 3. zsírsav specifikus lipázok Hasznosítás: gyógyászat, élelmiszeripar (pl. sajtgyártás), tisztítószerek, bioüzemanyagok (biodízel) Termelő fajok: Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, egyes élesztőgombák, és Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Micrococcus baktériumok, emlős hasnyálmirigy, máj, magvakban