Fotoszintézis III. The Dark Biochemistry A CO2 asszimilációja: avagy a sötét szakasz… Fotoszintézis III. A CO2 asszimilációja: fixáció és redukció Dr. Horváth Ferenc

2n H2O + n CO2 n (CH2O) + n H2O + n O2 redukált termék redukció oxidáció fény Ha nem fotoszintetikus úton előállított ATP-t és NADPH-t adunk sötétben lévő kloroplasztiszokhoz, akkor ugyanúgy megtörténik a CO2-fixáció, mintha megvilágítottuk volna őket.

A C2-es fotorespirációs (karbon oxidációs, glikolát) ciklus M. Calvin (1948-1953) tisztázta elsőként a CO2-fixáció folyamatát, azóta több alternatív utat is feltártak Melvin Calvin, Nobel díj 1961. A C3-as (primer termék 3-szénatomos molekula) fotoszintetikus szénredukció (Calvin-ciklus) A C2-es fotorespirációs (karbon oxidációs, glikolát) ciklus A CO2 fixáció C4-es útja (CO2 koncentráló mechanizmus) A CO2 fixáció C4-es útja a CAM növényekben A szacharóz és a keményítő szintézise és szabályozási mechanizmusok a CO2 asszimilácójában

1. A C3-as fotoszintetikus szénredukció (Calvin-ciklus) 5 másodperces megvilágítás után forró metanolban fixálva, és 2D papírkromatográfia PGA- glicerinsav-3-foszfát 30 másodperces megvilágítás után forró metanolban fixálva, és 2D papírkromatográfia Szénben jelzett hidrogénkarbonát ion, H14CO3- adagolásával a széndioxid fixálás elsődleges termékei kimutathatók

A Calvin-ciklus három fázisra tagolható Ribulóz-1,5- biszfoszfát Glicerinsav-3-foszfát Glicerinaldehid- 3-foszfát Szacharóz, keményítő

1. A sötétszakasz kezdete: karboxiláció A Calvin-ciklus folyamán a C3-as úton a széndioxid a ribulóz-1,5-biszfoszfáthoz kötődik és egy feltételezett hat szénatomos intermedier terméken keresztül két molekula glicerinsav-3-foszfáttá alakul át. A glicerinsav-3-foszfát a fotoszintetikus CO2-fixáció első stabil terméke

RUBISCO Ribulóz-1,5-biszfoszfát-karboxiláz-oxigenáz a reakciót katalizáló enzim Kettős enzimaktivitású – karboxiláz és oxigenáz (3:1) Kompetíció, ha mindkét szubsztrátum jelen van A kloroplasztisz sztrómájában található

A RUBISCO SZERKEZETE L8S8 alegységek (56 kDa, kloroplasztiszban szintetizálódik; 14 kDa, sejtmagban kódolt) small (rbcS) and the large (rbcL) subunit of rubisco A katalitikus hely a nagyobbik alegységen található

Rubisco: a levél összes fehérje tartalmának több, mint 50%-a N-raktár, a Föld népességének minden tagjára 20 kg jut… Évente 200 milliárd tonna CO2-t fixál A fehér és szürke a nagy alegység dimereket, a narancs és kék a kis alegység dimereket mutatja.

A Rubisco aktiválása karbamilációval Az aktiváció CO2 és Mg2+ megkötésével és proton felszabadításával jár, így a megvilágítás hatására bekövetkező sztróma pH emelkedés és a Mg2+ koncentráció növekedés serkenti az aktivációt.

A Rubisco-aktiváz működése A Rubisco-aktiváz eltávolítja a kötött RuBP-ot az inaktív, dekarbamilált Rubisco-ról egy ATP-t igénylő reakcióban. A szabad Rubisco ezután CO2 és Mg2+ kötésével karbamilálódhat. A Rubisco-aktivázt a fény a tioredoxin-rendszeren keresztül aktiválja (később).

2. A redukciós fázis kezdete Foszforilációs lépés 3-foszfoglicerát-kináz (PGA) Ha a glicerinsav-3-foszfát mennyisége nagyobb, mint a glicerinsav-1,3-biszfoszfáté, akkor a reakció a jelzett irányban játszódik le (glikolízisben fordítva) Az ATP mennyiség 2/3-a itt használódik fel.

Redukciós lépés Glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz A NADPH mennyisége limitálja a reakciót, az enzim aktivitását a fény növeli

A regenerációs fázis kezdete G3P – DHAP izomer átalakulás Trióz-foszfát izomeráz DHAP:G3P = 22:1 A regenerációs fázis kezdete Aldoláz

Fruktóz-1,6-biszfoszfatáz eritróz-4-foszfát xilulóz-5-foszfát Transzketoláz

Szedoheptulóz-1,7-biszfoszfatáz Aldoláz szedoheptulóz-1,7-biszfoszfát Szedoheptulóz-1,7-biszfoszfatáz Transzketoláz ribóz-5-foszfát xilulóz-5-foszfát

Ribulóz-5-foszfát epimeráz izomerizáció Ribóz-foszfát-izomeráz Foszforibulo-kináz v. ribulóz-5-foszfát kináz - fény-aktivált enzim - a regeneráció zárólépése - az ATP 1/3-a itt használódik fel

A sötét szakasz legfontosabb biokémiai folyamatai - karboxilációs fázis ribulóz-1,5-bifoszfát + CO2 = 2 glicerinsav-3-foszfát Katalizálja: a ribulóz-1,5-bifoszfát-karboxiláz, oxigenáz (RUBISCO) - redukció szakasza foszforiláció: az ATP 2/3 részének felhasználása redukció: a redukált NADPH felhasználása a glicerinsav-3- foszfát redukciójára - regeneráció a ribulóz-1,5-biszfoszfát-karboxiláz regenerálása: 6 glicerinsav-3-foszfát  3 ribulóz-1,5-biszfoszfát + 1 trióz-foszfát Nyereség ciklusonként egy trióz-foszfát!

A Calvin-ciklus jelentősége Három pentóz-foszfátból 3 molekula széndioxid megkötésével 6 trióz-foszfát keletkezik A három pentóz-foszfát regenerálódik A 3 széndioxid molekulából a nettó eredmény 1 exportálódó trióz-foszfát Ez cukrok (szacharóz), zsírsavak, aminosavak szintézisére szolgál A folyamat során 9 ATP és 6 NADPH használódik fel

A Calvin-ciklus regulációja A fotoszintetikus elektrontranszportlánc működését elsősorban a NADP+, az ADP és Pi mennyisége szabja meg. Sötétben: a redukált NADPH mennyiség 5-20%, ATP/ADP arány 0,1-0,2; sztróma pH = 7 Fényen: a redukált NADPH mennyiség 40-50%, ATP/ADP arány 1-5, sztróma pH = 8-8,5 (enzim optimum) Fényen, CO2 hiányában: a redukált NADPH mennyiség 90% A Calvin-ciklus működését szabályozza: 1, A trióz-foszfát/ortofoszfát transzlokátor (később) 2, A fény Fényre aktiválódó enzimek: Rubisco-aktiváz NADP:gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz Fruktóz-1,6-biszfoszfát foszfatáz Szedoheptulóz-1,7-biszfoszfát foszfatáz Ribulóz-5-foszfát kináz (foszforibulo-kináz)

A Calvin-ciklus számos enzimét a fényfüggő ferredoxin-tioredoxin rendszer aktiválja Fény  PS I  a célenzimek diszulfid-csoportjainak redukálása szulfhidrillé a redukált tioredoxin fehérje segítségével. Így kerülnek a célenzimek aktív állapotba

2. A C2-es fotorespirációs (karbon oxidációs, glikolát) ciklus A Rubisco kettős aktivitásának következménye… Magas hőmérséklet  oldott CO2/O2 arány csökken

2. A C2-es fotorespirációs (karbon oxidációs, glikolát) ciklus - a Rubisco oxigenáz aktivitása következtében ("parazita") - CO2/O2 koncentrációk, hőmérséklet-függő - a kloroplasztisz, a peroxiszóma és a mitokondrium közreműködésével jön létre a ciklus

A) A kloroplasztiszban: Ru-1,5-BP + O2  glikolsav-foszfát + glicerinsav-3-foszfát glikolsav-foszfát + H2O  glikolsav + Pi B) A peroxiszómában (1): glikolsav + O2  glioxálsav + H2O2 (glikolsav oxidáz) (a glioxálsav visszajuthat a kloroplasztiszba, ahol NADPH felhasználásával újra glikolsavvá alakulhat, vagy glioxálsav + glutaminsav  glicin + α-ketoglutársav (transzamináció) C) A mitokondriumban: glicin + NAD+ + H4-folát  NADH + CO2 + NH4+ + metilén H4-folát metilén H4-folát + H2O + glicin  szerin + H4-folát D) A szerin visszajut a peroxiszómába: szerin + α-ketoglutársav  hidroxi-piruvát + glutaminsav hidroxi-piruvát + NADH + H+  glicerinsav + NAD+ E) A kloroplasztiszban: glicerinsav + ATP  glicerinsav-3-foszfát + ADP + H+

GOGAT ATP

2. A C2-es fotorespirációs (karbon oxidációs, glikolát) ciklus Összegezve: Minden 2 molekula glikolsav-foszfát (2 x 2 = 4 C atom), mely a Calvin-ciklusból a RuBP oxigenálódása miatt vész el, 1 molekula glicerinsav-3-foszfáttá (C3) + 1 molekula CO2-dá alakul. Más szóval, az oxigenálódás miatt elveszett szén 75%-át a fotorespirációs ciklus visszavezeti a Calvin-ciklusba. A fotorespirációs ciklussal viszont a CO2 fixáció teljes energiaigénye megnő. A C2-ciklusban 3 mól O2 felvétele 1 mól CO2 felszabadulást eredményez 2 mól ATP + 2 mól redukálószer felhasználása mellett.

A CO2 fixáció C4-es útja (CO2 koncentráló mechanizmus) Probléma: a hőmérséklet emelésével a CO2 és O2 oldhatósága megváltozik úgy, hogy a CO2/O2 arány csökken. Ezért a Rubisco oxigenáz aktivitása erősebbé válik. A sztómák is záródnak a vízvesztés megakadályozása miatt, így tovább csökken a rendelkezésre álló CO2 mennyisége.  C4 stratégia C4-es növények jellegzetességei: A primer fixációs termékek 4 szénatomosak, pl. oxálecetsav, almasav és aszparaginsav A CO2 fixáció fényen történik A négyszénatomos molekulákból 1 szénatom adódik a C3-as ciklus felé Kétféle fotoszintetikus sejttípus van bennük (mezofill és hüvelyparenchima sejtek)

C3 és C4 levélszerkezet A C4-es növények anatómiája szembeszökően különbözik a C3-as növényekétől. Csak a C4-es növényekben található a hüvelyparenchima (bundle sheath) vagy Kranz sejtek. A széndioxid elsődleges kötését a PEP karboxiláz enzim katalizálja a mezofill sejtek citoplazmájában.

A kukoricalevél tipikus Kranz-anatómiája

C4 levél szerkezet és a C4 út CO2 Mezofill sejt Hüvely- parenchima sejt Levélér (szállítószövet) A C4 növény levél fotoszintetizáló sejtek Sztóma C4 levél felépítés PEP karboxiláz Oxálecetsav (4 C) PEP (3 C) Almasav (4 C) ADP ATP Piruvát (3 C) CALVIN CIKLUS Cukor Szállítószövet primér fixációs termék C4 sav (oxálecetsav) foszfoenol-piruvát (PEP) karboxilálódik a C4-es és a C3 ciklus térben elválasztódik: speciális anatómia (mezofill és hüvelyparenchima) trópusi, szubtrópusi növényekben

A foszfoenol-piruvát karboxiláz (PEP)… rendkívül nagy affinitással végzi a karboxilációs reakciót

A C4 alapciklus lépései: 1) PEP karboxiláció a MEZOFILL sejtek citoplazmájában oxálecetsav  malát, aszpartát 2) A C4 sav transzportja a HÜVELYPARENCHIMA-ba 3) A C4 sav (almasav, aszparaginsav) dekarboxilációja a CO2 fixációja a C3-as ciklusban 4) A C3 sav (piruvát, alanin) transzportja  MEZOFILL

NADP-almasav-enzim (NAPD-ME) típus

A CO2 fixáció C4-es útja (CO2 koncentráló mechanizmus) A CO2 koncentrálódása 8-10-szeres a C3-as levélhez képest. Energiamérleg: ellentétben a C3-as növényekkel, nem 3 ATP és 2 NADPH, hanem 5 ATP és 2 NADPH / 1 CO2 a CO2 koncentráláshoz több energia szükséges, melynek nyeresége, hogy nincs fotorespiráció Fény-regulált kulcsenzimek: PEP karboxiláz NADP-almasav dehidrogenáz (tioredoxin) Piruvát-ortofoszfát-dikináz

A dekarboxilációs mechanizmus alapján 3 típus i) NADP-almasav enzim típus (NADP-ME, kloroplasztisz) ii) Foszfoenol-piruvát-karboxikináz típus (PEP-CK, citoplazma) iii) NAD-almasav enzim típus (NAD-ME, mitokondrium)

A kloroplasztiszok szerkezete és elhelyezkedése a különböző fixációs típusú hüvelyparenchima sejtekben Klp centrifugálisan, nincsenek gránumok (nincs lineáris e-trp), mert az almasav a CO2-on kívül redukáló erőt (NADPH-t) is biztosít Az ATP előállításához elegendő a ciklikus fotofoszforilációs aktivitás Pl. Zea mays - kukorica Vannak gránumok, klp centrifugálisan Pl. Panicum maximum - pázsitkóró Vannak gránumok, klp centripetálisan Pl. Amaranthus retroflexus – szőrös disznóparéj, Panicum miliaceum - köles

4. A CO2 fixáció C4-es útja a CAM növényekben Crassulacean Acid Metabolism Crassulaceae Cactaceae Euphorbiaceae Liliaceae Bromeliaceae…

A CAM útvonal hasonló a C4 úthoz A lépések térbeli elkülönülése. A C4 növényekben, a szén fixálása és a Calvin ciklus eltérő sejtekben zajlik. (a) A lépések időbeli elkülönülése. A CAM növényekben, a szén fixálása és a Calvin ciklus ugyanabban a sejtben de eltérő időben zajlik. (b) Ananász Cukornád Hüvelyparenchima sejt Mezofill sejt Szerves sav CALVIN CIKLUS Cukor CO2 C4 CAM CO2 négy szénatomos savakba épül (szén fixálás) Éjszaka Nappal 1 2 A szerves savak- ból CO2 szabadul fel a Calvin ciklus számára

4. A CO2 fixáció C4-es útja a CAM növényekben karboxiláció /dekarboxiláció időben elválasztva - sivatagi növények Éjjel: sztómák nyitva PEP + CO2  oxálecetsav  almasav  vakuólum ("sötét savanyodás") Nappal: zárt sztómák dekarboxiláció, CO2  Calvin ciklus C3 savak  trióz-P  keményítő, szacharóz CAM növényekben a PEP-karboxiláz kettős funkciójú éjjel: karboxiláz (foszforilált forma) nappal: dekarboxiláz (defoszforilált, almasav-gátolt)

A CO2 fixáció C4-es útja a CAM növényekben

A PEP-karboxiláz nappali inaktív, és éjszakai aktív formája

5. A szaharóz és a keményítő szintézise

Fr2,6-biszfoszfát gátlás

5. A szaharóz és a keményítő szintézise - keményítő: a kloroplasztiszban szaharóz: a citoplazmában közös lépések a trióz-P-tól a glukóz-1-P-ig izoenzimek: pl. fruktóz-1,6-biszfoszfát foszfatáz kloroplasztiszban: tioredoxin citoszolban: fruktóz-2,6-biszfoszfát keményítő: ADP-glükóz szaharóz: UDP-glükóz Trióz-P megoszlás: trióz-P/Pi transzlokátor (antiport) Pi reguláló szerep Regulátor a citoszolban: fruktóz-2,6-biszfoszfát Fr-1,6-BP  Fr-6-P átalakulásnál (, inhibitor; , aktivátor)

A szaharóz és a keményítő szintézise egymással versengő folyamatok

A cukorszintézis regulátora: a fruktóz-2,6-biszfoszfát