Microbiological methods developed within the LACREMED projectGuideline Microbiološke metode razvijene u okviru LACREMED projektuSmernice A LACREMED projekten belül kifejleszett mikrobiológiai módszerek Útmutató LACREMED Development of an enzymological (laccase-based) remediation product and technology HUSRB/1002/214/147 Razvoj proizvoda i tehnologije za remedijaciju na bazi primene enzima (lakaze) Enzim- (lakkáz-) alapú bioremediációs termék és technológia kifejlesztése Ovaj dokument je odštampan uz finansijsku podršku Evropske unije. Za sadržaj ovog dokumenta je odgovoran isključivo Tehnološki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu, Srbija, i sadržaj ovog dokumenta ne odražava zvanično mišljenje Evropske unije i/ili Direktorata. Ez a dokumentum az Európai Unió pénzügyi támogatásával valósult meg. A dokumentum tartalmáért teljes mértékben az Újvidéki Egyetem, Technológiai Kar, Szerbia vállalja a felel ő sséget, és az semmilyen körülmények között nem tekinthet ő az Európai Unió és/vagy az Irányító Hatóság állásfoglalását tükröz ő tartalomnak. This document has been produced with the financial assistance of the European Union. The content of the document is the sole responsibility of the Faculty of Technology, University of Novi Sad, Serbia, and can under no circumstances be regarded as reflecting the position of the European Union and/or the Managing Authority. University of Novi Sad, Faculty of Technology Novi Sad, Serbia Újvidéki Egyetem, Technológiai Kar Univerzitet u Novom Sadu, Tehnološki fakultet Novi Sad, Srbija Editor/Szerkesztő: Prof. Dr. Biljana Škrbić, Edition: 30 copies, LACREMED©2013

Harmful xenobiotics are abundant in the environment because of the intensive application of different pesticides in the agriculture. Most of these compounds are harmful with proved or suspected toxic, carcinogenic, mutagenic, teratogenic or endocrine disruptor effect. Some of them enter into the food chain when plants take up them from contaminated water or agricultural soil. Laccases (benzenediol: oxygen oxido-reductases, EC ) are polyphenol oxidases, containing four copper atoms, therefore they are usually called multicopper oxidases. Laccases have received much attention from researchers during the past decades, because they have wide substrate range, and shown to be useful for the removal of toxic compounds, like chlorinated aniline and phenol xenobiotics (BOLLAG, 1992). Presence of these substances even at very low concentrations in waters and agricultural soils creates substantial danger: they and their degradation products could be mutagenic, carcinogenic and teratogenic. In certain cases, the degradation products may pose greater risks than the parent compounds (WEI et al., 2011). Laccases are produced in many fungal species belonging to ascomycetes and basidiomycetes groups, accordingly, the enzyme has already been purified from various fungi. Laccases are typical for the woodrotting basidiomycetes and a related group of litter-decomposing saprotrophic fungi. Laccases utilize broad range of substrates, so they could oxidize various xenobiotics and their degradation products. Moreover, they could react with different redox mediators such as ABTS, methionine, phenol and syringaldehyde. These are low molecular weight compounds which could act as redox mediators after oxidization and could oxidize other molecules expanding the spectrum of laccases (CAMARERO et al., 2004). Up to now, more than 100 laccases have been purified and more or less characterized from fungi. The molecular weight of a typical fungal laccase is about kDa, and they have around pH 4.0 isoelectric point. Several laccase isoenzymes have been detected in many fungal species (BALDRIAN, 2005), for example Pleurotus ostreatus has at least 10 of them (TÉLLEZ-TÉLLEZ et al., 2005). Like most fungal extracellular enzymes, laccases are glycoproteins. The glycosylation ranges are between 10% and 25%. (SHLEEV et al., 2004). Fungal laccases have pH optimum in the lower pH range. In the case of ABTS substrate, the pH optimum is generally lower than 4.0 (BALDRIAN, 2005).2 LACREMED Guideline on microbiological methods developed in Smernice mikrobioloških metoda razvijenih u projektu Kifejlesztett mikrobiológiai módszerek útmutatója A különböző peszticidek mezőgazdaságban történő alkalmazása miatt ártalmas xenobiotikumok vannak jelen a környezetben. Ezeknek a vegyületeknek a többsége bizonyított vagy feltételezett toxikus, karcinogén, mutagén, teratogén vagy endokrin diszruptor hatással rendelkezik. Némelyikük bejut a táplálkozási láncba is, mivel a növények felveszik őket a szennyezett vizekből vagy mez ő gazdasági talajokból. A lakkázok (benzéndiol: oxigén oxido-reduktázok, EC ) polifenol-oxidázok, melyek négy rézatomot tartalmaznak, ezért „multikopper-oxidázok”-nak is nevezik őket. A lakkázokra az elmúlt évtizedekben a kutatók kiemelt figyelmet fordítottak, mivel széles a szubsztrátkörük és alkalmasnak bizonyultak toxikus vegyületek, pl. klórozott anilin- és fenol xenobiotikumok eltávolítására. (BOLLAG és mtsai, 1992). Ezeknek a vegyületeknek a jelenléte vizekben és mezőgazdasági talajokban már nagyon kis koncentrációkban is komoly veszélyt jelent: a vegyületek és bomlástermékeik ugyanis mutagén, karcinogén és teratogén hatásúak lehetnek. Bizonyos esetekben a bomlástermékek az alapvegyületeknél is nagyobb kockázatot jelenthetnek (WEI és mtsai., 2011). Lakkázok termelésére számos, a tömlősgombák és bazídiumos gombák csoportjaiba tartozó gombafaj képes, ennek következtében az enzimet különböző gombafajokból sikerült már kitisztítani. A lakkázok a korhasztó bazídiumos gombák és az avarbontó szaprotróf gombák egy csoportjának tipikus enzimei. A szubsztrátok széles körét képesek felhasználni, így képesek különböző xenobiotikumokat és bomlástermékeiket is oxidálni. Ezen túl különböző redox- mediátorokkal (pl. ABTS, metionin, fenol és sziringaldehid) is képesek reagálni. Ezek a kis molekulasúlyú vegyületek oxidációjuk után redox mediátorként képesek működni és más molekulákat oxidálnak, kiterjesztve ezzel a lakkázok spektrumát (CAMARERO és mtsai., 2005). Mostanáig közel 100 lakkázt tisztítottak és jellemeztek gombákból. Egy tipikus gomba-lakkáz molekulasúlya kDa, izoelektromos pontja pedig pH 4.0 körüli. Sok gombafajban számos lakkáz izoenzimet sikerült kimutatni (BALDRIAN, 2006), a Pleurotus ostreatus például legalább 10 izoenzimmel rendelkezik (TÉLLEZ- TÉLLEZ és mtsai., 2005). A legtöbb, gombák által termelt extracelluláris enzimhez hasonlóan a lakkázok is glikoproteinek. A glikoziláció mértéke 10% és 25% közötti (SHLEEV és mtsai., 2004). A gomba-lakkázok pH-optimuma az alacsonyabb pH-tartományba esik, ABTS szubsztrát esetében általában alacsonyabb, mint 4.0 (BALDRIAN, 2006). Guaiacol-containing plates used as indicators of laccase production Lakkáztermelés kimutatására alkalmazott guajakol-tartalmú táplemezek Podloge sa gvajakolom korišćene kao indikatori proizvodnje lakaza

3 Opasne materije se često nalaze u životnoj sredini delom i zbog široke primene različitih pesticida u poljoprivredi. Mnogi pesticidi i njihovi degradacioni proizvodi imaju toksična, kancerogena, mutagena ili teratogena svojstva, a takođe mogu negativno uticati i na rad endokrinih žlezda. Neki od njih ulaze u lanac ishrane usvajanjem od strane biljaka koje žive u zagađenoj vodi ili na zagađenom poljoprivrednom zemljištu. Lakaze (benzendiol:kiseonik oksido-reduktaze, EC ) su polifenolne oksidaze, koje sadrže četiri atoma bakra, pa se obično nazivaju višebakarne oksidaze. Lakaze su privukle pažnju istarživača poslednjih decenija, jer su pokazale mogućnost razgradnje širokog spektra zagađujućih materija (kao što su hlorovani anilini i fenolni ksenobiotici) te su i korisne za njihovo uklanjanje (BOLLAG,1992). Prisustvo ovih ksenobiotika, čak i u malim koncentracijama u vodi i poljoprivrednom zemljištu, predstavlja opasnost, jer mogu imati kancerogena, mutagena i teratogena svojstva. U određenim slučajevima, proizvodi razgradnje polaznih zagađujućih materija (npr. pesticida) mogu da predstavljaju veći rizik po zdravlje ljudi i životnu sredinu nego jedinjenja iz kojih su ti proizvodi nastali (WEI i sar.,2011). Lakaze predstavljaju proizvode metabolizma gljiva koje pripadaju grupi askomiceta i bazidiomiceta, i do sada su dobijene u prečišćenom obliku od raznih vrsta gljiva. Lakaze su tipične za pošumljena područja gde se najčešće javlaju gljive prouzrokovači truleži drveta i slične saprotrofne gljive. Lakaze imaju sposobnost da oksiduju materije, uključujući i razne ksenobiotike i njihove degradacione proizvode. Šta više, lakaze mogu da reaguju sa različitim prenosiocima elektrona (redoks medijatorima) kao što su ABTS, metionin, fenol i siringaldehid. Medijatori su jedinjenja male molekulske mase koji imaju ulogu posrednika u prenosu elektrona nakon oksidacije između enzima i supstrata i koji mogu da oksiduju druge molekule i, na taj način, proširuju spektar jedinjenja na koje deluju lakaze (CAMARERO et al., 2004). Do sada je izolovano više od 100 vrsta lakaza iz raznih gljiva. Molekulska masa lakaza gljiva obično iznosi oko kDa i njihova izoelektrična tačka je oko pH vrednosti 4,0. Nekoliko izomera enzima lakaze je detektovano u mnogim vrstama gljiva (TELLEZ-TELLEZ et al., 2005), kao što je u slučaju gljive Pleurotus ostreatus iz koje je izolovano više od 10 izomernih enzima. Kao i većina ekstracelularnih enzima i lakaze su glikoproteini. Opseg glikolizacije enzima kreće od 10% do 25% (SHLEEV et al., 2004). Lakaze gljiva imaju optimalnu aktivnost pri nižim pH vrednostima. U slučaju supstrata ABTS, optimalna vrednost pH je obično niža od 4,0 (BALDRIAN, 2005). LACREMED Guideline on microbiological methods developed in Smernice mikrobioloških metoda razvijenih u projektu Kifejlesztett mikrobiológiai módszerek útmutatója

LACREMED Guideline on microbiological methods developed in Smernice mikrobioloških metoda razvijenih u projektu Kifejlesztett mikrobiológiai módszerek útmutatója Experimental conditions/Eksperimentalni uslovi/Kísérleti körülmények Isolation and identification of laccase- producing fungi from environmental samples For the isolation of laccase-producing white-rot fungi, one liter of basal medium (BM) contains: 0.5 g KH 2 PO 4, 0.2 g MgSO 4.7H 2 O, 0.1 g NH 4 NO 3, 0.1 g KCl, 0.02 g FeSO 4, 0.05 g Ca(NO 3 ) 2.4H 2 O, 2 g malt extract and 15 g agar. After sterilization 0.4 ml guaiacol is to be added for indicating the laccase activity. For the isolation of laccase producers from air the isolation medium (LI) is the following for 1 liter: 10 ml glicerol, 1 g arginine, 1 g KH 2 PO 4, 1 g K 2 HPO 4, 1 g MgSO 4.7H 2 O, g FeSO 4, ZnSO 4 and CuSO 4. The fungal DNA extractions can be carried out from fresh mycelia with Aqua Genomic Solution Kit, according to the manufacturer’s instructions. The identification of the isolates can be performed by amplification and partial sequence analysis of the internal transcribed spacer (ITS) region, using universal primers ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) and ITS5 (5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) according to WHITE et al. (1990). Sequence analyses can be carried using the NCBI BLAST program (ALTSCHUL et al., 1990, Lakkáztermelő gombák izolálása és azonosítása környezeti mintákból A lakkáztermelő fehérkorhasztó gombák izolálására alkalmazott alaptáptalaj literenként a következő összetevőket tartalmazta: 0,5 g KH 2 PO 4, 0,2 g MgSO 4.7H 2 O, 0,1 g NH 4 NO 3, 0,1 g KCl, 0,02 g FeSO 4, 0,05 g Ca(NO 3 ) 2.4H 2 O, 2 g malátakivonat és 15 g agar. Sterilizálás után a táptalajt 0,4 ml guajakollal kell kiegészíteni a lakkáz aktivitások kimutatása céljából. A lakkáztermelők levegőből történő izolálására alkalmazható LI táptalaj a következő összetevőket tartalmazza literenként: 10 ml glicerol, 1 g arginin, 1 g KH 2 PO 4, 1 g K 2 HPO 4, 1 g MgSO 4.7H 2 O, 0,002 g FeSO 4, 0,002 ZnSO 4 és 0,002 CuSO 4. A gombaizolátumok DNS-ének kivonása friss micéliumból történik az Aqua Genomic Solution Kit felhasználásával, a gyártó utasításai szerint. Az izolátumok azonosítása a köztes átíródó elválasztó (ITS) régió amplifikálásával és részleges szekvenciaelemzésével történhet az ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) és ITS5 (5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) univerzális indítószekvenciák felhasználásával WHITE és mtsai. (1990) szerint. A szekvenciaelemzések az NCBI BLAST program ( ALTSCHUL és mtsai., 1990) felhasználásával kivitelezhetők. Izolacija i karakterizacija gljiva iz životne sredine sa sposobnošću stvaranja lakaza Za izolaciju gljiva bele truleži sposobnih za stvaranje lakaza, jedan litar osnovnog medijuma sadrži: 0,5 g KH 2 PO 4, 0,2 g MgSO 4. 7H 2 O, 0,1 g NH 4 NO 3, 0,1 g KCl, 0,02 g FeSO 4, 0,05 g Ca(NO 3 ) 2. 4H 2 O, 2 g ekstrakta slada i 15 g agara. Nakon sterilizacije, a u cilju utvrđivanja aktivnosti lakaza neophodno je dodati 0,4 ml gvajakola. Za izolaciju gliva iz vazduha sposobnih za stvaranje lakaza koristi se sledeća podloga: 10 ml glicerola, 1 g arginina, 1 g KH 2 PO 4, 1 g K 2 HPO 4, 1 g MgSO 4. 7H 2 O, 0,002 g FeSO 4, 0,002 g ZnSO 4 i 0,002 g CuSO 4 (sadržaj je definisan za 1 litar poldloge). Ekstrakcije DNK gljiva može se izvršiti iz svežih micelija pomoću “Aqua Genomic Solution Kit” prema uputstvima proizvođača. Indentifikacija izolata se može izvršiti analizama amplifikacije i parcijalnim sekvenciranjem regiona (engl. “internal transcribed spacer”), koristeći univerzalne prajmere ITS4 (5’- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) i ITS5 (5’- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) u skladu sa preporukama WHITE i sar. (1990). Sekvence se mogu analizirati pomoću NCBI BLAST programa (ALTSCHUL et al., 1990, 4

5 Sequence chromatogram of a fungal ITS region Egy gomba ITS-régiójának szekvenciakromatogrammja Sekvencijalni hromatogaram gljivičnog ITS regiona Experimental conditions/Eksperimentalni uslovi/Kísérleti körülmények Investigation of laccase production The production of laccases can be investigated in different liquid media. ME contains 20 g malt extract, 20 g glucose, 1 g peptone per liter. MEM liquid media: one liter of ME base media supplemented with 80 μl of minerals (1.0 g CaCl 2 ·2H 2 O, 1.0 g FeSO 4 ·7H 2 O, 0.1 g ZnSO 4 ·7H 2 O, 0.16 g CuSO 4 ·5H 2 O, and 1.0 g Na 2 EDTA per liter). MEMX media contains in addition to MEM, 1% xylan as indicator. Fifty milliliters of liquid media are to be inoculated with agar pieces cut from well-grown mycelium. After 6 days of incubation at 28°C (180 rpm), the samples have to be centrifuged at 8000g for 10 minutes. The tenfold dilution of the cell free ferment broths serves as a basis for the activity assays. Laccase activity can be determined by measuring the oxidation of ABTS [2,2-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)] spectrophotometrically after 5 min incubation at 436 nm. The reaction mixture contains 5 mM ABTS in 25 mM succinate buffer (pH 4.5) (KIISKINEN ET AL., 2002 and 2004). A lakkáztermelés vizsgálata A lakkázok termelését különböző tápoldatokban lehet vizsgálni. Az ME tápoldat 20 g malátakivonatot, 20 g glükózt és 1 g peptont tartalmaz literenként. A MEM tápoldat a ME alaptápoldat 1 literének 80  l ásványi oldattal (1,0 g CaCl 2 ·2H 2 O, 1,0 g FeSO 4 ·7H 2 O, 0,1 g ZnSO 4 ·7H 2 O, 0,16 g CuSO 4 ·5H 2 O és 1,0 g Na 2 EDTA literenként). történő kiegészítésével készíthető el. A MEMX tápoldat a MEM-hez képest még 1% xilánt tartalmaz indikátorként. A tápoldatok 50 milliliterét jól növekedő micéliumból vágott agardarabokkal kell leoltani. Hat nap 28 °C-on, 180 rpm-mel történő rázatás után a mintákat 10 percig, 8000 g-vel centrifugáljuk. A aktivitásmérések alapjául a sejtmentes fermentlevek tízszeres hígítása szolgál. A lakkáz aktivitásokat az ABTS [2,2-azinobisz-(3-etilbenzthiazolin-6-szulfonát)] oxidációjának mérése útján határozhatjuk meg 5 perc inkubáció után, 436 nm-en végzett spektrofotometriás méréssel. A reakcióelegy 5 mM ABTS-t tartalmaz 25 mM szukcinát pufferben (pH 4,5) (KIISKINEN ÉS MTSAI., 2002 és 2004). Ispitivanje stvaranja lakaza Enzyme activities of laccase producer fungi in different liquid media Lakkáztermelő gombák enzimaktivitásai különböző tápoldatokban Enzimske aktivnosti plesni-proizvođača lakaza u različitim tečnim podlogama Stvaranje lakaza može biti ispitivano u različitim tečnim podlogama ME, MEM, MEMX. Podloga ME sadrži 20 g ekstrakta slada, 20 g glukoze, 1 g peptona (po litri podloge). MEM tečna podloga sadrži jedan litar osnovne podloge ME obogaćene sa 80 µl minerala (1,0 g CaCl 2 ·2H 2 O, 1,0 g FeSO 4 ·7H 2 O, 0,1 g ZnSO 4 ·7H 2 O, 0,16 g CuSO 4 ·5H 2 O i 1.0 g Na 2 EDTA). Podloga MEMX sadrži 1% ksilan kao indikator u MEM podlozi. U 50 ml podloge se unesu delovi agara podloge na kojoj su se dobro razvile micele. Nakon inkubacije u trajanju od 6 dana na 28°C (180 rpm), uzorci se centrifugiraju (8000 g) 10 minuta. Kao osnova za ispitivanje aktivnosti koristi se desetostruko razblažena podloga iz koje su ukonjene ćelije. Aktivnost lakaza se može odrediti spektrometrijski na 436 nm merenjem oksidacije ABTS [2,2-azinobis-(3-etilbenzdiazo-line-6-sulfonata)] nakon inkubacije od 5 minuta. Reakciona smesa sadrži 5 mM ABTS u 25 mM sukcinatnom puferu (pH 4.5) (KIISKINEN ET AL., 2002 and 2004). LACREMED Guideline on microbiological methods developed in Smernice mikrobioloških metoda razvijenih u projektu Kifejlesztett mikrobiológiai módszerek útmutatója DP1 Ganoderma sp. Pleurotus ostreatus HK35

6 Experimental conditions/Eksperimentalni uslovi/Kísérleti körülmények Investigation of the the degradation of different aniline and phenol derivatives by fungal laccases The following xenobiotics were investigated: 2,4-dichlorophenol; 2-methyl-4-chlorophenol; 3-chloroaniline; 4-chloroaniline; 2,6-dimethylaniline; 3,4- dichloroaniline, 3-chloro-4-methylaniline. Reaction mixtures contained 1.5 ml of the ferment broth, which was mixed with equal volume of the distinct pesticides (0.25 mM in 50 mM succinate buffer, pH 4.5). Final concentrations of the xenobiotics were mM in 25 mM succinate buffer. If applied, the concentration of the mediator (guaiacol) was 1 mM. The mixtures were incubated at 25 °C overnight. The reactions were terminated by removing the laccase from the system with membrane filtration. The remaining concentrations of the xenobiotics were determined by methods described in the LACREMED guidelines about the analytical methods for xenobiotics determination. Különböző anilin- és fenolszármazékok gombaeredetű lakkázok általi lebontásának vizsgálata Vizsgált xenobiotikumok: 2,4-diklórfenol; 2-metil-4-klórfenol; 3-klóranilin; 4-klóranilin; 2,6-dimetilanilin; 3,4-diklóranilin, 3-klór-4-metilanilin. A reakcióelegyek 1,5 ml fermentlevet tartalmaztak, melyet a peszticidek azonos térfogatú oldataival (0,25 mM mennyiség 50 mM szukcinát pufferben, pH 4,5) kevertünk. A xenobiotikumok végkoncentrációja 0,125 mM volt 25 mM szukcinát pufferben. Amennyiben mediátor (guajakol) is felhasználásra került, a koncentrációja 1 mM volt. Az elegyeket 25 °C-on, egy éjszakán át inkubáltuk. A reakciókat a lakkáz membránsz ű réssel történő eltávolításával állítottuk le. A maradék xenobiotikumok koncentrációinak meghatározása a xenobiotikumok meghatározására szolgáló analitikai módszereket ismertető LACREMED útmutatóban leírtak szerint történt. Ispitivanje razgradnje različitih anilinskih i fenolnih derivata od strane lakaza izdvojenih iz gljiva Degradation of xenobiotics by fungal strains of Ganoderma resinaceum and G. adspersum with and without mediator Xenobiotikumok lebontása Ganoderma resinaceum és G. adspersum gombatörzsek által mediátorral és mediátor nélkül Degradacija ksenobiotika od strane gljivičnih sojeva Ganoderma resinaceum i G. adspersum sa i bez medijatora Ispitana je razgradnja sledećih ksenobiotika: 2,4-dihlorfenola; 2-metil-4-hlorfenola; 3-hloranilina; 4-hloroanilina; 2,6-dimetilanilina; 3,4-dihloranilina, 3-hlor- 4-metilanilina. Reakcione smese su sadržale 1,5 ml mikrobiološke podloge, pomešane sa jednakim zapreminama pojedinačnih jedinjenja od interesa (0,25 mM odgovarajuće zagađujuće materije u 50 Mm sukcinatnom puferu, pH 4.5). Krajnja koncentracija ksenobiotika bila je 0,125 mM u 25 mM sukcinatnom puferu. U slučaju ispitivanja uticaja medijatora dodat je gvajakol čija je krajnja koncentracija bila 1 mM. Smesa je inkubirana na 25 °C tokom cele noći. Reakcije razgradnje su prekidane uklanjanjem lakaza iz sistema membranskom filtracijom. Preostale koncentracije ksenobiotika su određene pomoću metoda opisanih u LACREMED smernicama o analitičkim metodama za određivanjen sadržaja ksenobiotika. REFERENCES/LITERATURA/IRODALOM ALTSCHUL S.F., GISH W., MILLER W., MYERS E.W., LIPMAN D.J. (1990) Journal of Molecular Biology 215, BALDRIAN P. (2006) FEMS Microbiolological Review 30, BOLLAG J.-M., SHUTTLEWORTH K. L., ANDERSON D. H. (1988) Applied and Environmental Microbiology CAMARERO S., IBARRA D., MARTÍNEZ M.J., MARTÍNEZ A.T. (2005) Applied and Environmental Microbiology KIISKINEN L.-L., RÄTTÖ M., KRUUS K. (2004) Journal of Applied Microbiology 97, 640–646. KIISKINEN L.-L., VIIKARI L., KRUUS K. (2002) Applied Microbiolology and Biotechnology 59, SHLEEV S.V., MOROZOVA O., NIKITINA O., GORSHINA E.S., RUSINOVA T., SEREZHENKOV V.A., BURBAEV D.S., GAZARYAN I.G., YAROPOLOV A.I. (2004) Biochimie 86, TÉLLEZ-TÉLLEZ M., SÁNCHEZ C., LOERA O., DÍAZ-GODÍNEZ G. (2005) Biotechnology Letters 27, WEI H-R, RHOADES M.G., SHEA P.J. (2011): Formation, adsorption, and stability of N-Nitrosoatrazine in water and soil. In: It’s all in the water: studies of materials and conditions in fresh and salt water bodies; BENVENUTO M., et al.; ACS Symposium Series; American Chemical Society: Washington, DC, WHITE T.M., BRUNS T., LEE S., TAYLOR J. (1990): Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA for phylogenetics. In: INNIS M.A., GELFAND D.H., SNINSKY J.J., WHITE T.J. (Eds.). PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, CA, pp LACREMED Guideline on microbiological methods developed in Smernice mikrobioloških metoda razvijenih u projektu Kifejlesztett mikrobiológiai módszerek útmutatója