KÖRNYEZETVÉDELMI BIOTECHNOLÓGIA BIODEGRADÁCIÓ, BIOREMEDIÁCIÓ A környezet alkotó elemei egymással szoros összefüggésben léteznek, az egyes elemekreható ártalmak a környezet egészére kihatnak. Ha a fennálló egyensúlyt megbontjuk, beláthatalan környezetvédelmi problémákkal találhatjuk szembe magunkat. Fejlődő ipar felhalmozódó hulladék veszélyes anyagok   A Föld mikroflórájának válasza az újonnan megjelenő anyagokra adaptáció

Alapfogalmak biotechnológia “biotechnologie - (EREKY Károly, 1917) all work by which products are produced from raw materials with the help of living organisms” [Ereky] alkalmazott mikrobiológia - biokonverzió, biotranszformáció különböző (toxikus) vegyületek mikrobiális átalakítása - biodegradáció nem kívánatos, környezetre káros anyagok lebontása mikrobiális úton - bioremediáció (= tisztítás) a környezet megtisztítása a toxikus hulladékoktól mikrobiális módszerekkel környezetvédelem - megelőzés - tervszerű környezetfejlesztés - környezetünk megóvása, védelme

A biotechnológiai eljárások szempontjából legfontosabb enzimek oxidázok, hidroxilázok, dehydrogenázok reduktázok, hydrogenázok hidrolázok izomerázok proteázok, lipázok A biotechnológiában fontos mikroorganizmus csoportok Metanogének Metilotrófok Clostridiumok Tejsav baktériumok Bacillusok Pseudomonasok Fotoszintetizáló baktériumok, algák Streptomycesek Élesztők Fonalas gombák

Fotoszint. baktériumok, algák: Metanogének: archea obligát vagy strict anaerobok biogáz Metilotrófok: aerobok C1-C3 szénforrások hasznosítása pl. Metanotrófok metán oxidáció Clostridiumok: obligát anaerobok Gram pozitívok hőstabil endospóra rendkívül sokféle reakcióra képesek Tejsav baktériumok: anaerobok élelemiszeripar Bacillusok: endospóra extracelluláris enzimek Pseudomonasok: aerob heterotróf, Gram negatívok exopoliszaharidok biodegradáció Fotoszint. baktériumok, algák: aerob vagy anaerob biopolimerek Fotoszintézis, CO2 fixálás Streptomycesek: aerob, spórázó szervezetek antibiotikum termelők extracelluláris enzimek Élesztők: alkoholgyártás pékélesztő Fonalas gombák: heterotróf eukaryota szaprofita vagy parazita jellegzetes sejtfal spóraképzők antibiotikumok biokonverzió

XENOS = IDEGEN SZINTETIKUS = NEM TERMÉSZETES EREDETŰ Példák: peszticidek, herbicidek, oldószerek, egyes szerves vegyületek Lebontásukra megoldás: - fizikai - kémiai módszerek - biológiai Az 1960-as évek elején felfedezték, hogy számos talajlakó mikroorganizmus képes a xenobiotikumok bontására Egyféle szennyezés ritkán fordul elő, ált. vegyes hulladék sokféle enzim, mikroorg. szükséges Legproblémásabb vegyületek az aromás, valamint halogén elem tartalmú vegyületek

Szerves oldószer hatása az organizmusra egyik fő támadáspont a membrán ahogy az oldószer akkumulálódik a membránban sérülnek annak funkciói: 1, aspecifikus permeabilizáció E. coli : fenol jelenlétében ATP és K+ szabadul ki a sejtekből toluol hatására RNS, foszfolipid és fehérje szivárgás 2, H+ és más ionok passzív áramlása membránon keresztül  sérül az ATP szintézis 3, membránban lévő fehérjék funkciója is sérül 4, megváltozik, nő a membrán fluiditása  változik a membrán struktúrája, stabilitása és membránon belüli kölcsönhatások membránfelszín hidrációs tulajdonságai változnak membrán vastagság változik membrán felszín növekedés

Adaptációs mechanizmusok védekezési mechanizmusok törzsről törzsre változnak I. Citoplazma és külső membrán adaptáció: mind lipid mind fehérje szinten cél: szolvens által megzavart membrán fluiditásának, stabilitásának újrateremtése I/1. zsírsav összetétel - megváltozik telített és telítetlen zsírsavak aránya alkohol és aceton növeli telítetlen zsírsavak arányát a membránban apoláris oldószerek pl. benzol csökkenti szaturáció változás  fluiditás változás  szolvens hatását kompenzálja "homoviszkózus adaptáció" - membránban telítetlen zsírsavak cis  trans izomerizációja  emeli a membrán rendezettségét és csökkenti a fluiditást

I/2. változik lipidek fejcsoportjainak összetétele P. putida: difoszfatidil-glicerol (kardiolipin) aránya nő P. putida Idaho: foszfatidiletanolamin nő I/3. foszfolipid szintézis fokozódik I/4. változik fehérje összetétel I/5. lipopoliszacharid összetétel változás külső membránban magának lipopoliszacharidoknak és lipoproteineknek is nő a mennyisége LPS hidrofóbicitás csökkentő hatása van I/6. külső membrán porinjai P. putida OmpL mutáns: hiperszenzitív szolvensekre P. aeruginosa OmpF hiány növeli a toleranciát I/7. zsíroldékony vegyületek Zymomonas mobilis: etanol jelenlétében hopanoidok mennyisége nő Staphylococcus aureus: olajsav jelenlétében karotenoid szintézis nő

Biotechnológiai potenciál II. sejtfelszín hidrofóbicitás csökkenése növeli a szolvens toleranciát P. putida toluol adaptáció után sejtek felszíne kevésbé hidrofób (sok fehérje és LPS) III. ionok stabilizáló szerepe Mg2+, Ca2+ stabilizálják Gr(-)-ok külső membránját pl.: Pseudomonas sp. - toluol IV. Szerves oldószerek degradációja vagy kevésbé toxikus formává való transzformációja V. Aktív exkréció a sejtből Biotechnológiai potenciál bioremediáció új, szerves oldószerekben stabil proteázok, lipázok egyéb enzimek

A biodegradációs eljárásokban legismertebb, leggyakrabban előforduló mikroorganizmusok Pseudomonasok Sphingomonasok Rhodococcusok Bacillusok Sugárgombák A (szubsztituált) aromás szerves oldószerek lebontására az oxigenáz, dehalogenáz enzimek alkalmasak

LEBONTÁSI ÚTVONAL LEHET AEROB, ANAEROB aerob: mono- és dioxigenázok anaerob: reduktív dehalogenáció, oxidált vegyületek: szulfát, nitrát

Aerob vs. anaerob metabolizmus

Aanerob metabolizmus benzoil-CoA-n keresztül

Benzoil-CoA konverziója acetil-CoA-vá

Monooxigenázok (hidroxilázok) az O2 molekula egyik atomját építik be a célmolekulába SH2 + O2 = SO + H2O (internal monooxigenáz, a szubsztrátról jön az elektron) S + O2 + H2X = SO(H) + OH-_ + X (external monooxigenáz) Példák: p-hydroxybenzoát hydroxiláz család phenol 2-hidroxiláz alkil csoport hidroxiláz (metán monooxigenáz) kámfor 5 monooxigenáz (Citokróm P-450 család)

enzimatikus szintézisek Dioxigenázok, hidroxilázok Aromás gyűrű hidroxilázok + Y H O X 4-X-katekolát H O X NADH+H NAD + Sztereospecifikus hidroxilálás enzimatikus szintézisek O X 2 hidroxiláz 4-X-dihidroxihexadién Aromás gyűrűt hasító dioxigenázok R O H + 2 C intradiol cleaving/ 3,4-dioxygenases proximal-extradiol cleaving/ 2,3-dioxygenases distal-extradiol cleaving/ 4,5-dioxygenases

Mono- és dioxigenáz családok I.

Mono- és dioxigenáz családok II.

Mono- és dioxigenáz családok III.

METANOTRÓFOK: MMO=metán monooxigenáz Két fajta enzim: membrán kötött (pMMO, Cu+), citoplazmatikus szolubilis (sMMO, Cu-) pMMO sMMO A metán oxidációja mellett NADH oxidáció (regenerálni kell) sMMO: széles szubsztráspecificitás több száz szerves vegyület oxidációja  bioremediáció CH4 O2 O2 Xred NADH+H+ Xox NAD+ H2O H2O CH3OH további alkalmazás: metanolgyártás

enzimatikus szintézisek Dioxigenázok, hidroxilázok Aromás gyűrű hidroxilázok + Y H O X 4-X-katekolát H O X NADH+H NAD + Sztereospecifikus hidroxilálás enzimatikus szintézisek O X 2 hidroxiláz 4-X-dihidroxihexadién Aromás gyűrűt hasító dioxigenázok R O H + 2 C intradiol cleaving/ 3,4-dioxygenases proximal-extradiol cleaving/ 2,3-dioxygenases distal-extradiol cleaving/ 4,5-dioxygenases

Aromás gyűrűt oxidáló hydroxilázok

Hydroxilázok szerepe a bioorganikus kémiában Sphingomonas yanoikuyae biphenil dioxigenáz sztereoszelektív szintézisek például még a morfin, vagy a vanília szintézisében is

Hidroxilázok szerepe a biodegradációban

Hidroxilázok szerepe a klórozott vegyületek biodegradációjában

Az aromás diolok eddig ismert lebontási útvonalai

A gyűrűhasítás mechanizmusa intradiol extradiol

Szubsztituált (klórozott) szénhidrogénekre módosított ortho útvonal

Szubsztrátspecificitás Nem adaptált sejtek (periférikus útvonal) Adaptált sejtek (periférikus útvonal)

Szubsztrátspecificitás II. Centrális útvonal, specializálódott sejtek ezt az adott útvonal minden enzimjére meg kellene vizsgálni az útvonal mentén a specificitás változik az enzimek specfificitását bővíteni kell

Szubsztrátspecificitás bővítése a sejtek adaptációja, hosszú idő (6 – 8 hónap) irányított evolúció az útvonalak kombinálása egyesével, vagy...

A gének sokszor (mega)plazmidon vannak Plasmid Size (kb) Conjugative Incompatibility group Substrate Host Reference Peripheral pathways   TOL 117 + P-9 Xylenes, toluene, toluate Pseudomonas putida 9 9, 100 100, 101 101, 102 102, 172 172   NAH7 83 Naphthalene via salicylate 9, 37 37, 101 101, 139 139, 180 180, 181 181   pWW60-1 87 Pseudomonas sp. 17   pDTG1 145   SAL1 85 Salicylate 9, 22 22, 101 101, 180 180, 181 181   pKF1 82    ND Biphenyl via benzoate Acinetobacter sp. (reclassified 5 5, 53 53   as Rhodococcus globerulus)   pWW100   200 105   methylbiphenyls via toluates   pWW110 >200 18   pCITI 100 Aniline 2   pEB 253 Ethylbenzene Pseudomonas fluorescens 12   pRE4 Isopropylbenzene 38 38, 39 39   pWW174 200 Benzene Acinetobacter calcoaceticus 175   pHMT112 112 157   pEST1005 44 Phenol 94   pVI150 mega P-2 Phenol, cresols, 8 8, 146 146   3,4-Dimethylphenol Central pathways   pAC25 3-Chlorobenzoate 26   pJP4 77 P-1 3-Chlorobenzoate, 2,4-D Ralstonia eutropha (formerly 33 Alcaligenes eutrophus)   pBR60 Alcaligenes sp. 179   pRC10 45 2,4-D Flavobacterium sp. 28   pP51 1,2,4-Trichlorobenzene 165   pMAB1 90 Burkholderia (formerly 14    Pseudomonas cepacia    aND, not determined; 2,4-D, 2,4-dichlorophenoxyacetate.

Operon struktúrák benzoesav bontás bifenil bontás módosított orto útvonal

Szabályozás a transzkripciós faktor szubsztrátspecificitása

Metabolikus útvonalak kombinálása keresztezéssel 2. plazmid 3. plazmid 4. plazmid 1. plazmid konjug. konjug. A törzs B törzs C törzs D törzs Plazmid rekombináció konjugáció F törzs E törzs Strain G Problémák azért még vannak