Gének koordinált regulációjának két fő mechanizmusa baktériumokban operon: gének egy lókuszban, közös transzkript, közös regulátor policisztronos elrendezés regulon: gének szétszórva a genomban, közös regulátor operon regulon

A TRANSZKRIPCIÓS SZABÁLYOZÁS FŐBB GLOBÁLIS STRATÉGIÁI PROKARIÓTÁKBAN indukálószer represszor inaktív represszor derepresszált KATABOLIKUS aktív represszált BIOSZINTETIKUS indukált aktív aktivátor inaktív aktivátor RNS polimeráz negatív szabályozás pozitív szabályozás indukció represszió inaktív aktivátor inaktív aktív aktivátor indukálószer

A transzkripciós faktorok és aDNS közötti specifikus kölcsönhatás ún A transzkripciós faktorok és aDNS közötti specifikus kölcsönhatás ún. Hélix-Turn-Hélix (HTH) motívumon megy keresztül HTH Motívumok: csgD: NNEIARSLFISENTVKTH LY merR: IGEVALLCDINPVTLRAWQR luxR: SWDISKILGCSERTVTFHLT lehet a faktor N vagy C terminálisán, a másik végen szokott lenni a ligand, kofaktor kötő régió

BAKTERIÁLIS TRANSZKRIPCIÓS FAKTOROK FŐBB CSALÁDJAI Faktor család Tagok AraC család AraC, MelR, RhaS, RhaR, SoxS LysR család LysR, OxyR, MetR, CysB Crp család Crp, Fnr MerR család SoxR Két komponensű NarL, OmpR, Arc szabályozó család Lac represszor család LacI, GalR MetJ család MetJ

Aktiváció a gén expresszióban I. Kölcsönhatás: - CTD-nel (CRP) - 70 4-es régiójával ( cI aktivátor) - NTD-nel (CRP) -  alegységgel (DnaA) - ’ alegységgel (N4 single-stranded DNA kötő fehérje) - CTD-nel és 70 4-es régiójával (FNR) Positive activation of gene expression Virgil A Rhodius, Stephen JW Busby Current Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159.

Aktiváció a gén expresszióban II. Promóter konformáció megváltoztatása: - “-35” és “-10” régió azonos oldalra kerül (MerR, SoxR) - DNS visszahajlik és az aktiváló cis szekvencia RNAP fölé kerül - DNS konformáció változást indukál (FIS, IHF) Positive activation of gene expression Virgil A Rhodius, Stephen JW Busby Current Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159.

Távoli aktivátor helyek segítséget igényelnek DNS-hajlító fehérje (pl. IHF) Specifius kötőhely

Aktiváció a gén expresszióban III. Positive activation of gene expression Virgil A Rhodius, Stephen JW Busby Current Opinion in Microbiology 1998, 1:152-159 2 aktivátortól függő promóterek: - az aktivátor kötődése egy másik aktivátortól függ (eukarióta) - aktivátor kötődése egy másik aktivátor áthelyeződését eredményezi (CRP-MalT a malK promóteren) - független aktiváció (70 vagy NTD és CTD) - represszor müködését gátolja (FIS-NARL/P-FNR)

Transzkripció repressziója baktériumokban

FNR O2 - fumarát nitrát reduktáz regulátor - citoplazmatikus szenzor-regulátor - dimer[4Fe-4S]2+ DNS-t köt - monomer[2Fe-2S]2+ inaktív - aenaerob respirációra (+) vagy (-) hatás - pO2 1 mbar alatt - TTGAT-N4-ATCAA konszenzus szekvencia - [2Fe-2S]2+  [4Fe-4S]2+ (in vitro) Cys, Fe, DTT, NifS - Pseudomonas: ANR; Bacillus: FNR Rhodobacter sphaeroides: FnrL O2 FNRred FNRox

Két komponensű szabályozó rendszerek Komponensek - egy szenzor kináz és egy DNS kötő regulátor - E. coli genom 2% - kb 50 különböző 2 komponensű rendszer - 3 alcsalád: OmpR, FixJ és NtrC

A bakteriális kétkomponensű szabályozó rendszerek működése elve szenzor kináz fehérje DNS kötő fehérje Érzékelő Foszforilációs Felvevő DNS kötő szignál transzfoszforiláció DNS

OmpR - OmpR (E. coli): porin szerveződés szabályozása ozmózis változás hatására - általában 70 használó transzkripciót aktivál - kölcsönhatás az RNS polimeráz  alegységének C terminálisával - ha az N terminális foszforilálódik megszünik a gátló hatása a C terminális DNS kötő domén felé

FixJ NtrC - általában 70 használó transzkripciót aktivál - receiver domén deléciója esetén aktív transzkripció lesz NtrC - N terminális receiver és C terminális DNS kötő domén között egy központi ATPáz domén (glicin gazdag “Walker box”) - DNS kötő domén FIS-hez homológ (FIS: eukarióta enhancer kötő fehérje) - általában 54 használó transzkripciót aktivál

ArcA/B O2 - aerobic respiratory control - ArcB (szenzor kináz): sejt redox és metabolikus helyzet (elektron transzport változást érzékel) - ArcA(citoplazmatikus regulátor): ArcB foszforilálja  aktív - pO2 1-5 mbar között - TATTTaa konszenzus szekvencia - Haemophilus: ArcA - E. coli homológ gén: OmpR ArcA ArcB P O2 P ArcAP

oxigén mentes környezet Az ArcAB és FNR anaerob aktivációja ArcA ArcB oxigén mentes környezet FNR P

Kétkomponensű rendszerek vége NarX/L és NarP/Q - nitrát regulator - NarX és NarQ: membrán szenzor kináz - NarL és NarP: citoplazmatikus regulátor - szignál: nitrát és nitrit - nitrát metabolizmusra hat - NarL és NarP különböző génekre különböző atás  a génexpresszió finom hangolása NO3 NarPP NarX NarQ NarLP P Kétkomponensű rendszerek vége

A lac operon kettős szabályozása laktóz (allolaktóz) indukál glükóz gátol, cAMP/CAP-n keresztül glükóz/egyéb cukor kiiktatása tápból nem célszerű  glükóz szabályozás kikapcsolása

lac (és trp) alapú promóterek erősség “-35” “-10” trp AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCA tac AATGAGCTGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGA lacUV5 CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGA lac CCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGGTGTGTGGA lacUV5  lac promóter UV

A transzkripciós faktorok sokoldalúak…. Ara C Ara PBAD represszió +Ara PBAD indukció RNS polimeráz PBAD AraC

Transzkripció termináció baktériumokban Rho független Rho függő a) hurok képződés indul b) hurok képződés indul hibrid destabilizálódik c) termináció a) Rho kötődik és üldözi a polimerázt b) hurok képződés, polimeráz megáll c) Rho helikáz felszabadítja a transzkriptet, termináció

A transzkripció és a transzláció párhuzamosan megy baktériumokban

A triptofán operon szerkezete protein antranilát szintáz indol-glicerin szintáz triptofán szintáz A triptofán operon szerkezete

A triptofán operon szabályozása

Termináció – attenuáció – trp operon

Termináció - antitermináció túl sokat nem lehet vele kezdeni, génen belüli sajátság

E. coli-ban fehérje túltermeltetésre használt promóterek

mRNS degradáció baktériumokban mRNS stabilitás prokariótákban néhány perc, eukariótákban órás nagyságrend   előbb utóbb minden RNS lebomlik mRNS stabilitását meghatározó faktorok: - belső, saját szerkezet - a környezet hatására bekövetkezett változás a degradációs apparátusban puf operon (a fotoszintetikus komplex komponensei) Rhodobacter capsulatus degradációja O2 hatására felgyorsul policisztronos rendszerek esetén az alegységek arányának szabályozása a mRNS régióinak eltérő stabilitásával

A R. capsulatus puf mRNS régióinak stabilitása

mRNS degradáció baktériumokban, vizsgálati módszerek  - transzkripció gátlása (pl. rifampicin) t=0 időpontban, majd  időközönként mintavétel és RNS analízis (Northern..) a degradációs mechanizmusban szerepet játszó gének deléciója, hőmérséklet érzékeny expressziós változatának kialakítása - in vitro transzkripció jelölt nukleotidokkal, a kapott termék inkubációja a sejtextraktummal különböző ideig, majd analízis gélelektroforézissel, kvantitálás

RNázok, RNS degradáció Bacterial exoribonucleases Polynucleotide phosphorylase Ribonuclease PH Ribonuclease II Ribonuclease R RNase D Ribonuclease T Ribonuclease BN Oligoribonuclease Bacterial endoribonucleases Ribonuclease I Ribonuclease III Ribonuclease P Ribonuclease E Ribonuclease HI A degradáció iránya virtuálisan 5'  3' irányú, de ilyen enzimaktivitást nem lehet kimutatni prokariótákban Megoldás: kombinált enzimműködés  degradoszóma

mRNS-t stabilizáló-destabilizáló tényezők

Az 5’ végi struktúra stabilizáló hatása a stabillizálódás a mRNS hurok struktúrájában van nem a riboszóma véd, a stabilizáló effektus átvihető más génekre

mRNS-eket stabilizáló (védő) tényezők 5’ végi trifoszfát RNS struktúra riboszóma

A degradoszóma felépítése

Az RNaseE elsődleges felépítése Érdekes módon sok bakteriális genomban nincs meg

A degradoszóma komponensei I. Endoribonuclease E (RNáz E) 1061 aminosav  118 kDa fehérje, virtuálisan 180 kDa (oka prolin gazdag régió) felismerő hely: (A/G)AUU(A/T) vagy egy komplex másodlagos struktúra 5' monofoszfátot preferál 5' trifoszfát stabilizál N-terminális régió (50 kDa) hasonlít a Caf-re (cytoplasmic axial filament protein)  feltételezett funkció a belső RNS transzportban N terminális 70 aa (S1 domén) hasonlít a PNPase és RnaseII (illetve (CSP, cold shock protein, RNS chaperon) RNS kötő doménjére C-terminális a degradoszóma egyéb komponenseire megfelelő kötő domének

A degradoszóma komponensei II. PNPase (polynucleotide phosphorylase) 78 kDa alegységek, homotrimer 3'  5' foszfát függő processzív exonukleáz, ribonukleotid difoszfátok képződnek poliadenilációs aktivitás Polyphosphate Kinase (PPK) funkció: ATP regeneráció, polifoszfát (inhibiálja a degradációt) eltávolítás ppk mínusz törzs : megnövekedett mRNS stabilitás 80 kDa alegységek, homotetramer, sok van E. coli-ban

ATP hiányában a hurokstruktúra stabil marad A degradoszóma komponensei III. Helikáz ATP függő DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) helikáz 50 kDa RhlB a másodlagos struktúrák kinyitása szétroncsolása ATP hiányában a hurokstruktúra stabil marad

Egyéb – mRNS degradációjában résztvevő – enzimek RNáz II 70 kDa monomer, a sejt 3'  5' exoribonukláz aktivitásának 90%-a ribonukleotid monofoszfátok képződnek a PNPáz-zal együttes deléciója letális !!! PolyA polimerázok PAPI 53 kDa PAPII 35 kDa   poliadeniláció, 15- 50 bázis hosszú mRNS instabilitás

A mRNS degradáció mechanizmusa