Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A

SEJT-AGGREGÁCIÓS KULTÚRÁK Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 15. Előadás

TÁMOP /1/A Aggregációs sejtkultúrák Az aggregáció segítségével gyorsan alakíthatunk ki kisméretű szövetdarabkákat Az aggregáció szoros kapcsolatot alakít ki a sejtek között, amely segít növelni a sejtek túlélését és megfelelő élettani funkcióinak végrehajtását

TÁMOP /1/A Alapvető feltételek az aggregációs kultúrák kialakításához Sejtadhéziós molekulák (CAM, cellular adhesion molecule) jelenléte a sejtfelszínen Mátrix vagy mesterséges összetapadást segítő molekulák jelenléte, amely serkenti azon sejtek aggregációját, amelyek egyébként nem tapadnának össze

TÁMOP /1/A Sejtadhézió Sejt-mátrix interakciók Oldott állapotú ECM Integrinek Statikus ECM Kadherinek Sejt-sejt interakciók

TÁMOP /1/A A sejt-aggregáció kialakításának módszerei Aggregáció gravitációs kultúrákban Aggregáció alacsony tapadóképességű anyagokhoz Aggregáció scaffoldokon vagy kémiailag módosított felszínű anyagokon Aggregáció forgó vagy szuszpenziós kultúrákban Aggregáció bioreaktorokban

TÁMOP /1/A Gravitációs sejtkultúrák A sejtek „gömböcskék”-ké, ún. szferoid-okká állnak össze természetes módon, természetes nagyságú vagy megnövelt gravitációs mezőben Gravitációs kultúrák típusai: Szuszpenziós kultúrában kialakuló aggregátumok bioreaktorokban Függőcsepp-kutúrák Centrifugált aggregátumok

TÁMOP /1/A Szuszpenzióban kialakuló aggregátum kultúrák Magas sűrűségű sejtszuszpenziók szükségesek a kialakuláshoz A tenyésztés dinamikusan mozgásban levő kultúrákban lehetséges, a sejt-sejt kapcsolatok kialakulásához szükséges találkozások számának növelése érdekében A dinamikusan mozgásban levő sejtkultúrák kialakítására a sejtszuszpenziókat lehet mozgásban levő lemezeken, petri-csészékben vagy bioreaktorokban tenyészteni

TÁMOP /1/A Aggregáció forgó bioreaktorokban Forgó bioreaktor Adherens sejtekhez Forgó bioreaktor Sejtszuszpenziókhoz Mintavevő nyílások Töltőnyílás LSMMG NG Gravitációs erő Gravitációs erő Forgásirány Mintavevő nyílások Töltőnyílás Forgásirány

TÁMOP /1/A Bioreaktorok és sejt- aggregáció Rotációs bioreaktor: Rotációs bioreaktor: speciális bioreaktor, amelyben a sejtekre ható erők egyensúlya tartja szuszpenzióban a az aggregátumokoat. A nyíróerők minimálisak. Típusok: High aspect rotation vessel (HARV) Slow turning lateral vessel (STLV) Kevertetett bioreaktorok: Kevertetett bioreaktorok: különböző térfogatú edények léteznek, ipari célokra akár több, mint 100 l térfogat

TÁMOP /1/A Különböző sejttípusok aggregátumainak tenyésztése bioreaktorban Bioreaktor típusSejttípus Forgó bioreaktor HepG2 sejtek, humán őssejtek, humán bőr fibroblasztok, humán embrionális vesesejtek Kevertetett bioreaktor Porcsejtek, primer egér és patkány májsejtek, L6 mioblasztok, CHO sejtek

TÁMOP /1/A Sejt-aggregátumok felhasználása Sejt-aggregátumokFelhasználás CHO Rekombináns fehérjék szintézise Humán embrionális őssejtek Embrionális test (EB) kialakulása és differenciáció

TÁMOP /1/A I. Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp I. Vájt tárgylemez A mintát kaccsal a fedőlemezre helyezzük Olajcsepp Vazelin 180°

TÁMOP /1/A II. Microgravitációs sejtkultúra – Függőcsepp II. 180° Idő (napok) Az embrionális testek növekedése és a spontán csíralemez-differenciálódás megkezdődik 0 2 5

TÁMOP /1/A Egyforma embrionális testek tenyésztéséhez és az intercelluláris kapcsolatok szabályozásához szükséges mikrolemezek 40 mm 150 mm

TÁMOP /1/A Aggregáció alacsony adherenciájú felszínhez Az alacsony adherenciájú felszín segíti a szuszpenziós sejtkultúrák kialakulását A sejt-sejt kapcsolatok növekednek Néhány ECM-származékkal (pl. Martigel) borított felszín növeli a sejtek motilitását és sejtek közötti aggregációt.

TÁMOP /1/A A magas proliferációs képességgel rendelkező májsejtek szelekciója Természetes aggregáció PVLA potenciálisan jól használható mesterséges máj kialakítására a különböző koncentrációjú borítások révén PVLA (Poli-N-p-vinil venzil D-laktóz lakton amid) ASGP-R EgyébIntegrinEGF-RHGF-R Fas Májsejtek ASGP-R magas lassú proliferáció Szferoid kialakulása Májsejtek ASGP-R alacsony gyors proliferáció +EGF Sejtalak szabályozása Szferoid 100  g/ml PVLA-val borított edény PVLA bevonat koncentrációja ng/ml PVLA-val borított edény Kitapadás 1  g/ml PVLA bevonat 100  g/ml PVLA bevonat Lekerekedés E-Kadherin Epevezeték Májsejt

TÁMOP /1/A Sejtaggregáció serkentése mesterséges módszerekkel Polimerből álló híd képzése a sejtek között. Típusok: Természetes adhéziós molekula ECM-eredetű molekula része Polimer mátrix

TÁMOP /1/A Mesterséges sejt-aggregáció Aggregálódott sejtek Sejtek Bifunkcionális polimer

TÁMOP /1/A Sejtek keresztkötése biotinnal Avidin Sejtaggregátum Biotin hidrazid Perjodát-funkcionalizált sejtek

TÁMOP /1/A Felszínek kémiai módosítása Chitosan, természetes, biodegradábilis polimer (molekulatömeg: 810 kDa) Kémiailag módosított PEG (polietilén glikol) Laktonnal módosított eudragit PLGA nanogyöngyök Lektinek és származékaik

TÁMOP /1/A Chitosan

TÁMOP /1/A Kémiailag módosított PEG MA(PEG) n Methyl-PEG n -Amine Methyl-(#ethyleneglycol) amine H2NH2N CH 3 O O O O MA(PEG) 8 M.W Spacer arm 29.7 Å [ ] 8 CH 3 H2NH2N O MA(PEG) 12 M.W Spacer arm 43.9 Å H2NH2N [ ] 12 CH 3 O MA(PEG) 24 M.W Spacer arm 86.1 Å [ ] 24 CH 3 H2NH2N O

TÁMOP /1/A Lakton-módosított eudragit pH > 6 HOOC COOH HOOC COOH Ellenionok Ko-ionok COO - - OOC COO

TÁMOP /1/A PLGA nanogyöngyök Oldott polimer (PLGA) Diszperziósfázis Pumpa Pumpa Előkeverés Mágneses keverő Magasnyomású víz befolyás kifolyás

TÁMOP /1/A I. Lektinek és származékaik I. A sejtfelszíni molekulák szénhidrátcsoportjait képesek megkötni a lektinek fitohemagglutininekA lektinek, vagy fitohemagglutininek (PHA), olyan fehérjék, melyeknek nincsen sem enzimatikus sem immunológiai aktivitásuk, és reverzibilisen képesek szénhidrátokhoz kötődni azok megváltoztatása nélkül Mivel a lektinek specifikus, reverzibilis sejt-sejt adhéziós reakcióban vesznek részt, jól alkalmazhatóak sejtfelszíni molekulák keresztkötésén keresztül a sejtadhézió serkentésére

TÁMOP /1/A II. Lektinek és származékaik II. Hat lektin családHat lektin család ismeretes: –Legume lektinek (a pillangósvirágúak családjában) –Gabona-eredetű lektinek, –P-, C-, és S-típusú lektinek (állati fehérjék) –A pentraxinok (állati fehérjék) A lektinek sokfajta sejttípushoz kötődnek, amelyek különböző sejtfelszíni glikoproteinek vagy glikolipidek alkotórészei. A sejtek lehetnek vörösvértestek, leukémiás blasztok, élesztőgombák vagy baktériumok. A lektinek szénhidrátspecificitása is különböző lehet, mannóz, galaktóz, N-acetil-glükózamin, N- acetil-galaktózamin, L-fruktóz, és N-acetil- neraminsav. Mivel egy lektinmolekulán több szénhidrát-kötőhely található, képes agglutinálni a sejteket. A lektinek kötődése az egyes szénhidrátokra specifikus.

TÁMOP /1/A A lektinek által felismert N-glikánok típusai TypePHA Bisected di-, tridiantennary complex-type N-glycan Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin (E-PHA) Inhibitor: GalNAc Tri- and tetraantennary complex-type N-glycan Phaseolus vulgaris Leukoagglutinin (L-PHA) Inhibitor: GalNAc Tri- and tetraantennary complex-type N-glycan Datura stramonium Agglutinin (DSA) Inhibitor: Chitotriose (GlcNAc 3 )

TÁMOP /1/A Sejt-aggregáció scaffoldokon Homogén és heterogén sejtpopulációk aggregációja Sejtfelszíni fehérjék biotinálása és avidin alkalmazása keresztkötő ágensként

TÁMOP /1/A Nanoszerkezetű scaffold-ok Spontán összeszerelődő scaffold-ok Nanokompozit anyagok Nanoszálak

TÁMOP /1/A Nanoszerkezetű anyagok felhasználása AnyagJellemzőkFelhasználás Fullerének Szénatomok hexagonális és pentagonális térszerkezetbe rendeződve Gyógyszerek enkapszulációja, képalkotó vizsgálatok Fluoreszcens „Quantum dot”-ok Félvezetőkből készült nanokristályok Bioszenzorok, képalkotás Liposzómák Foszfolipid membránnal burkolt vezikulák Gyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás DedrimerekPolimer szerkezetek Gyógyszerek leadása, génterápiás alkalmazás Arany nanorészecskékKolloid arany Bioszenzorok, sejtszintű képalkotás Szuper-paramágneses vas-oxid Vas-oxidMRI kontrasztanyag

SZÖVETEK NYOMTATÁSA Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP /1/A Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 16. Előadás

TÁMOP /1/A A szövetnyomtatás alapjai Scaffoldmentes konstrukció Tisztított sejtek aggregált halmazait alkalmazzák A sejthalmazokból áll a „biotinta” A 3D szövetkonstrukciók felépítése a sejthalmazok spontán fúziós képességén alapul

TÁMOP /1/A I. Sejthalmazok fúziója 3D szövet-konstrukciókká I.

TÁMOP /1/A II. Sejthalmazok fúziója 3D szövet-konstrukciókká II. Közel helyezett sejtaggregátumok és embrionális szív mezenchima fragmentek gyűrű vagy csőszerű struktúrákká egyesülnek

TÁMOP /1/A Szervek nyomtatása 3D nyomtatás: 3D nyomtatás: a sejthalmazokat gyors, automatizált módszerrel rétegenként, biokompatibilis anyaggal körülvéve helyezzük egymásra, így alakul ki a 3D szerkezet. Szövetnyomtatás típusok: Lézernyomtatás (osteoszarkóma, embrionális carcinoma) Tintasugaras nyomtatás (hippocampális és kortikális neuronok)

TÁMOP /1/A Az első szövetnyomtató

TÁMOP /1/A I. Érett, szervspecifikus primer sejtek I. BiopsziaTisztítás Sejtkultúra TE-ben használható sejtek

TÁMOP /1/A II. Érett, szervspecifikus primer sejtek II. Biopszia Tisztítás TE-ben használhat ó sejtek Differenciálódott szöveti sejtek Szövetspecifikus rezidens őssejtek Sejtkultúrák

TÁMOP /1/A Érett, differenciálódott sejtek alkalmazása TE céljára Forrás: biopszia vagy reszekció Tisztítás Expanzió in vitro tenyésztés során Újradifferenciáltatás

TÁMOP /1/A Vérerek képzése szöveti nyomtatással Fontos a megfelelő nyomóerő alkalmazása

TÁMOP /1/A TE-vel előállított erek potenciális alkalmazása Koszorúér betegség, bypass készítése Trombózis kezelése Baleseti érsérülés Komplex szöveti szerkezetek kialakítása TE-vel