A Toll-like receptor ok szerepe diabetes mellitusban dr. Reismann Péter Semmelweis Egyetem II.sz. Belgyógyászati Klinika

A szervezet védekező rendszere Természetes immunválasz - veleszületett, általánosabb aktiválódásakor akut fázis reakciót indít el - gyulladásos folyamat indul be Szerzett immunválasz tanult specifikusabb lassabb folyamat

Toll receptor Toll-like receptor 1985: dorso-ventralis fejlődés Antifungalis- antimikróbás feladat

gyulladásos citokinek PAMP-PRR PAMP: pathogen associated molecular pattern kórokozóhoz kapcsolt molekuláris minta DAMP: danger associated molecular pattern veszélyhez asszociált molekuláris mintázat PRR: pattern recognition receptor minta felismerő receptor PAMP PRR DAMP sejtmag monocita gyulladásos citokinek

Toll-like receptorok

Toll-like receptor Interleukin-1 szupercsalád az intracelluláris homológia miatt 1-es típusú transzmembrán protein 21 leucinban gazdag motívum, amely a ligandkötésben és a dimeralizációban vesz részt.

Fibrinogén, fibronektin LPS Hsp 60 and 70 RSV F-protein TLR-4 oxLDL Szabad zsírsav Taxol Fibrinogén, fibronektin LPS Hsp 60 and 70 CD14 MD-2 citoplazma MyD88 TRIF IRF3 IRAK TRAF-6 MKK NEMO (IKKg) IKK complex IKKb IKKa JNK IL-1, IL-6, TNF-a IKB NF-KB sejtmag AP-1 NF-KB

TLR aktiváció a T-sejteken TLR expresszió mind az antigén prezentáló sejteken, mind a Treg sejteken! Autoimmun és gyulladásos folyamat szabályozás: már az aktiváció elején elindítja a folyamat szabályozott csillapítását!

Toll-like receptorok és diabetes 1-es típusú diabetes mellitus: proinflammatorikus áll. Monocyta TLR2 és TLR4 expresszió és aktiváció fokozott T1DM-ben TLR2 és TLR4 ligandok szintje emelkedett T1DM-ben, mint a Endotoxin – lipopolysaccharid Hsp60- heat shock protein 60 HMB1- high mobility group boksz 1 – késői sepsis gyulladásos mediator

TLR2 és 4 ligandok 1-es típusú DM   Controls (n = 37) Type 1 diabetes (n = 34) Endotoxin (nmol/l) 2.53 ± 0.67 3.32 ± 0.82** HMGB1 (nmol/l) 0.13 ± 0.04 0.20 ± 0.06** Hsp60 (pmol/l) 18.5 ± 5.0 23.2 ± 6.7** GAS6 (nmol/l) 11.2 ± 6.9 10.2 ± 5.9 Table 2 Levels of ligands of TLR2 and TLR4 Data are expressed as mean ± SD **p < 0.01 vs controls

Inzulin hatása a TLR expresszióra A hyperglycaemia elősegíti, az inzulinkezelés csökkenti a TLR-ek expresszióját

Vírus precipitálta diabetes BioBreeding diabetes rezisztens (BB-DR) patkányoknál diabetes jelentkezett, ha Kliham rat vírussal (KLV) fertőzték meg. A KLV egy egyszálú DNS parvovírus. A vírus nem közvetlenül a pancreast fertőzi meg, hanem megváltoztatja az egyensúlyt a pathogének és a szabálozó sejtek arányát, főként a CD4+CD45RClo sejtek arányát. Továbbá, ha a fertőzés mellé TLR aktiváló ligandokat is adnak, akkor a 23%-os arányú csak vírus indukálta diabetes arány 50-100% közé emelkedik a különböző TLR ligandoktól függően. Ezenfelül a NOD TLR2−/− egereknél a diabetes incidendia 50%-kal csökken a NOD TLR2+/+-hoz képest.

TLR4 és inzulin rezisztencia obezitás ? inzulin rezisztencia Obesitás - - krónikus proinflammatórikus állapot Lymphocyta beszűrődés a zsírsejtek körül a zsírszövetben. Fokozott proinflammatórikus citokin szint a zsírszövetben és a keringésben (pl. TNFa, IL-6) De hogy mi váltja ki, még nem teljes mértékben ismert! a keringő zsírsavak szintje túlsúlyosságban emelkedett, és a zsírsavak emelik a proinflamm. citokinek szintjét Az egyik kapocs: TLR4

TLR4 és szabad zsírsav Szabad zsírsav fokozza a TLR4 aktivációt TLR4 expresszió növekszik obesitásban

TLR4 és szabad zsírsav

TLR4 és inzulin rezisztencia

TLR4 és inzulin rezisztencia Monocyta-adipocyta sejtkultura TLR4-ligand TLR4 monocyta inzulin Proinflammatorikus cytokinek adipocyta Inzulin receptor IRS GLUT4

pattern recognition receptor Diabetes és diabeteses szövődmények ? RAGE PRR pattern recognition receptor TLR4 Természetes immunválasz

A TLR4 gén polimorfizmusa 9q32-33, két gyakori koszegregációs polimorfizmus (10%) cDNS-en start kodontól 3’ irányba 896. pozícióban: Adenin Guanin 299. pozícióban: Asparaginsav Glicin cDNS-en start kodontól 3’ irányba 1196. pozícióban: Citozin Timin 399. pozícióban: Threonin Izoleucin

TLR4 gén polimorfizmus hatása Az extracelluláris régiót érinti a-helikális struktúra felbomlik, b-fonal alakzattá alakul át A helyi töltési viszonyok változnak Zavart okozhat a TLR4 sejtmembránba szállításába Zavart okozhat a receptor-ligand kapcsolódásakor Zavart okozhat a co-receptorok megkötésében

TLR4 gén polimorfizmus klinikai jelentősége csökkenti a belégzett LPS-re létrejövő válaszreakciót      Arbour N et al TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans. Nature Genetic 25:187-191, 2000 növeli az esélyét Gram-negatív baktériumok okozta fertőzésnek Schwartz DA TLR4 and LPS hyporesponsiveness in humans. Int J Hyg Environ Health 205:221-7, 2002 - csökkenti a carotis-atheroszklerózis rizikóját  Kiechl S, Lorenz E, Reindl M, Wiedermann CJ, Oberhollenzer F, Bonora E, Willeit J, Schwartz DA Toll-like receptor 4 polymorphisms and atherogenesis. New Engl J Med 347:185-92, 2002 RSV bronchiolitis esélyét növeli. IBD és H.pylori okozta gyomor cc.-vel asszociált növeli a pravastatin kardioprotektív hatását Boekholdt SM, Agema WRP, Peters RJG, Zwinderman AH, van der Wall EE, Reitsma PH, Kastelein JJP, Jukema JW, REGRESS Study Group Variants of Toll like Receptor 4 modify the efficacy of statin therapy and the risk of cardiovascular events. Circulation 107:2416-2421, 2003 TLR4 hatása nem fertőző eredetű, de krónikus gyulladásos folyamatokban?

I. Diabetes mellitus és a természetes immunitás 1-es típusú DM: TLR függő interferon-a aktiváció insulinitist okoz 2-es típusú DM: akut fázis reakció, krónikus gyulladás, akut fázis proteinek (CRP, IL-6) Szövődmények: Intracelluláris stressz, Nf-kB aktiváció

Kérdésfelvetés és célkitűzés: Diabetes és TLR4 Kérdésfelvetés és célkitűzés: A TLR4 gén Asp299Gly/Thr399Ile funkcionális polimorfizmus vizsgálata 1-es és 2-es típusú cukorbetegségben a diabeteses nephropathia és a perifériás neuropathiaval összefüggésben

Diabetes és TLR4 Módszerek: Genotipizálás A polimorfizmus meghatározása PCR és restrikciós endonukleáz felhasználásával történt PCR-hez polimorfizmusra specifikus primerek Hasítás Asp2999Gly esetén NcoI Thr399Ile esetén HinfI endonukleázzal történt

Diabetes és TLR4 Genotipizálás: 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Vad típus Asp299Gly 1 2 3 4 5 6 7 8 Vad típus Thr399Ile

Diabetes és TLR4 Beteg kiválasztás: diabeteses járóbeteg rendelésen megjelent 1-es és 2-es típusú diabetes mellitusban szenvedő betegek előzetes írásbeli beleegyező nyilatkozat egyetemi etikai bizottság engedélyével részletes antopometriai, fizikai állapot, anyagcsere állapot felmérés: 776 beteg került bevonásra 246 1-es típusú DM 530 2-es típusú DM

Diabetes és TLR4 eredmény: 1-es típusú DM 2-es típusú DM Heterozigóta Asp299Gly/Thr399Ile 26 / 246 (HA: 10.6%) 65 / 530 (HA: 12.3%) Homozigóta Gly299Gly/Ile399Ile 1 / 530 (HA: 0.2% ) Nincs szignifikáns különbség (p = 0.63) HA: hordozási arány

1-es típusú diabetes 2-es típusú diabetes Vad típus Asp299Gly & Thr399ILe p-érték n = 220 n = 26 n = 465 n = 65 Diabetes időtartalma (év) 19 [7.9;29.7] 21 [19.3;22.7] 0.44 12 [10.7;12.3] 11 [8.6;12.8] 0.45 Nők aránya (%) 50.0 [43.4;56.6] 42.3 [23.3;61.3] 0.54 43.9 [39.4;48.4] 45.3 [33.1;57.5] 0.79 Életkor (év) 47 [45,4;48.6] 50 [44;56] 0.51 66 [64.5;66.5] 64 [61.2;66.4] 0.15 Dohányzás (%) 26.5 [19.5;33.5] 23.8 [5.6;42.0] 1.00 25.5 [20.6;30.5] 24.3 [10.5;38.1] Magas vérnyomás(%) 32.7 [26.5;38.9] 26.9 [9.9;44.0] 0.66 71.8 [67.7;75.9] 65.6 [54.0;77.3] 0.38 HbA1c érték (%) 7.3 [7.0;7.6] 7.1 [6.5;7.6] 7.3 [7.2;7.4] 7.0 [6.7;7.3] 0.19 Koleszterin szint (mmol/l) 4.9 [4.8;5.1] 5.0 [4.6;5.3] 0.94 5.1 [4.9;5.2] 4.9 [4.6;5.3] 0.49 Triglicerid szint (mmol/ll) 1.1 [0.9;1.2] 0.9 [0.7;1.1] 0.48 1.9 [1.8;2.0] 1.9 [1.6;2.3] 0.86 BMI 25.6 [21.3;29.9] 24.7 [21.3;28.1] 31.3 [26.0;36.6] 34.4 [29.5;39.3]

Diabetes és TLR4 eredmény: 1-es típusú DM 2-es típusú DM Vad Polim. Vad Polim. Vad Polim. Vad Polim. 1-es típusú DM 2-es típusú DM 1-es típusú DM 2-es típusú DM

Következtetések: I. vizsgálat: Diabetes és TLR4 Közvetlen összefüggést a TLR4 gén polimorfizmusa és a diabetes mellitus típusa között nem találtunk. Szoros összefüggés mutatkozott a TLR4 gén polimorfizmusa és a polyneuropathia előfordulása között 2-es típusú diabetes mellitusban. Hasonló összefüggést 1-es típusú DM-ben, vagy nephropathiával kapcsolatban nem tudtunk kimutatni.

Következtetések: I. vizsgálat: Diabetes és TLR4 A diabeteses polyneuropathia pathogenesise különbözhet az 1-es és a 2-es típúsú DM-ben A természetes immunválasz szerepet játszhat a 2-es típusú DM polyneuropathiájának kialakításában?

Köszönöm a figyelmüket!