II. rész DNS szintézis

Tartalomjegyzék 1. Watson és Crick DNS replikációs modellje 2. DNS replikációs modellek 3. Meselson és Stahl kísérlete 4. DNS szintézis, általános áttekintés 5. A replikációs villa 6. A vezető szál 7. A követő szál 8. Replikációs origó (prokarióta, eukarióta) 9. DNS-javító mechanizmusok

1. Watson és Crick DNS replikációs modellje A DNS szerkezete alapján már Watson és Crick javaslatot tettek a DNS molekula megduplázódásának mechanizmusára, miszerint a két szülői szál mintául szolgál az új szálak szintéziséhez. Watson és Crick ma már joggal klasszikusnak számító közleménye, melyben a DNS kettősspirál szerkezetét írták le, a Nature-ben (neves tudományos lap) jelent meg 1953. április 25-én. Már ebben a cikkben javaslatot tett a szerzőpáros a DNS megduplázódásának lehetséges mechanizmusára az újonnan megismert szerkezete alapján. A cikk végének sokszor idézett mondata: „Nem kerülte el figyelmünket, hogy a két szál komplementer bázispárjai a molekula megduplázódásának mechanizmusára is kézenfekvő megoldást kínál”. Egy következő közleményükben már pontosan leírták a DNS megduplázódására vonatkozó elképzelésüket, miszerint a két szál – a hidrogénkötések felbomlásával – elválik egymástól és mindkettő templátként/mintaként szolgál egy új szál szintéziséhez. Ennek eredményeként két, teljesen azonos bázissorrendű, duplaszálú DNS születik. Mindkét duplaszálú DNS-ben az egyik szál az eredeti, a másik az újonnan szintetizált szál. Később ezt a replikációs modellt nevezték szemikonzervatív modellnek. A Nature-ben megjelent cikk idézett részlete. …a két szál elválik egymástól és mindkettő alapján a komplementer bázispárok szerint egy-egy új szál szintetizálódik.

2. DNS replikációs modellek A DNS megduplázódására három lehetséges modell született: a szemikonzervatív, konzervatív és a diszperzív modellek. A szemikonzervatív modell szerint tehát – Watson és Crick javaslata szerint – a két szülői szál szétválik és mindkettő mintaként szolgál a két új szál szintéziséhez. Ez azt jelenti, hogy mindkét új duplaszálú DNS molekula egyik szála az eredeti szülői szál, a másik pedig az újonnan szintetizált szál. A konzervatív modellben ezzel szemben, a két eredeti szülői szál együtt marad (a szülői szálak megmaradnak, konzerválódnak) és a két új szál képezi a másik duplaszálú DNS-t. A diszperzív modell szerint mind a négy szál tartalmaz szülői és új DNS szál darabokat.

3. Meselson és Stahl kísérlete Meselson és Stahl kísérletükben kidolgoztak egy módszert, mellyel meg tudták különböztetni a DNS molekula eredeti és újonnan szintetizált szálait és ennek alapján kísérleti bizonyítékot szolgáltattak a szemikonzervatív replikációs modell mellett. Habár a szemikonzervatív modell mindenki számára kézenfekvőbbnek tűnt, mint a másik kettő, a kísérleti bizonyítékokat két évvel később Matthew Meselson és Franklin Stahl szolgáltatta szintén egy klasszikusnak számító híres kísérletükben. Meselson és Stahl kísérletének modell szervezete az ismert E. coli baktérium volt. Ismert, hogy a baktériumok örökítő anyaga egy membránhoz kötött cirkuláris (vagy lineáris) kromoszómába szerveződik, amely minden egyes sejtosztódás során megduplázódik. Egy baktériumtenyészetben a sejtek osztódása szinkronizálható, ami azt jelenti, hogy a sejtek többsége azonos sejtosztódási szakaszban van, így azok egy időben kezdenek osztódni. A cézium-klorid grádiens centrifugálás alapelve: A cézium-klorid grádiens centrifugálás gyakran használt laboratóriumi technika különböző sűrűségű komponensek szétválasztására. A technika lényege, hogy a centrifugális erő hatására a cézium-klorid oldatban egy sűrűségrádiens alakul ki a kémcsőben lefelé fokozatosan növekedve. Ha az E. coliból izolált DNS-t cézium-klorid oldatban centrifugálunk, a DNS addig a pontig vándorol a kémcsőben, ahol a saját sűrűsége megegyezik a cézium-klorid sűrűségével.

B. A második osztódási ciklus után. A kísérlet célja: Eldönteni, hogy melyik replikációs modell írja le helyesen a DNS replikáció mechanizmusát. A kísérlet hipotézise: A DNS a szemikonzervatív modell szerint replikálódik. A kísérlet menete és az eredmények: 1. Első lépésben több generáción keresztül E. coli baktériumokat tenyésztettek olyan tápoldatban, amelyben a nitrogénforrás 15N-izotópot tartalmazó ammónium-klorid volt. A sejtek DNS-ébe tehát csak nehéz N-izotóp épült be. 1/A Amikor ezekből a nehéz N-izotópon nőtt baktériumokból származó DNS-t cézium-klorid grádiensen centrifugálták, a DNS az ún. nehéz sávnak megfelelő magasságban helyezkedett el (ahol sűrűsége megegyezett a cézium-klorid grádiens sűrűségével). Ez a sáv sokkal alacsonyabban helyezkedett el, mint a normál 14N-izotópot tartalmazó DNS ún. könnyű sávja (a könnyű és nehéz sáv szétválasztását korábbi kísérletekben már kidolgozták). 2. Második lépésben a nehéz 15N-izotópot tartalmazó táptalajon felnőtt baktériumokat normál 14N-izotópot tartalmazó tápoldatba helyezték és generációsidőnként (kb. 20 percenként) a baktériumtenyészetből mintát vettek. A mintából DNS-t izoláltak és cézium-klorid grádiensen centrigugálták. A. Az első osztódási ciklus után (20 perccel az átoltás után) a tisztított DNS minta a nehéz és könnyű sávok között elhelyezkedő átmeneti sűrűségű sávot adott. B. A második osztódási ciklus után (40 perccel az átoltás után) vett DNS minta két sávot adott megközelítőleg azonos mennyiségű DNS tartalommal: egy átmeneti sűrűségűt és egy könnyű sávot. A Meselson-Stahl kísérlet 2. A nehéz 15N-izotópot tartalmazó táptalajon felnőtt baktériumokat normál 14N-izotópot tartalmazó táptalajra helyezték. 1. Nehéz 15N-izotópot tartalmazó táptalajon növekvő baktériumtenyészet. 1/A A nehéz 15N-izotópot tartalmazó DNS a cézium-klorid grádiensben mélyebbre vándorolt és az ún. nehéz sávot alkotta. A. Az első osztódási ciklus után (20 perccel az átoltás után) tisztított DNS minta a nehéz és könnyű sávok között elhelyezkedő átmeneti sűrűségű sávot adott. B. A második osztódási ciklus után.

A Meselson-Stahl kísérlet A kísérleti eredmények értelmezése: Az eredmények csak a szemikonzervatív replikációs modell alapján értelmezhetők. 1 A könnyű 14N-izotóp tartalmú táptalajon a nehéz N-izotópot tartalmazó kettősszálú DNS mindkét szála templátként szolgált egy-egy könnyű N-izotópot tartalmazó komplementer szál szintéziséhez. A születő két új duplaszálú DNS egyik szála nehéz, a másik könnyű N-izotópot tartalmazott, vagyis mindkét duplaszlú DNS átmeneti sűrűségű volt. 2. A második replikációs ciklusban a kiinduló DNS egyik szála könnyű, a másik nehéz N-izotópot tartalmazott. A könnyű szál mintájára egy másik könnyű lánc szintetizálódott, amely egy könnyű sávként jelent meg a cézium-klorid grádiens centrifugálásnál. A nehéz szál mellé szintén egy könnyű szál szintetizálódott és így a kettő együtt egy átmeneti sűrűségű sávot adott. 1. Az eredeti DNS két nehéz szálához egy-egy könnyű szál szintetizálódott, így a hibrid szálak átmeneti sűrűségűek lettek. 2. A második ciklusban is csak könnyű szálak szintetizálódtak a meglévő szálakat templátként használva. Így azonos arányban könnyű és átmeneti sűrűségű DNS molekulákat kapunk Következtetés: Ezek a sáveloszlások csak úgy jöhettek létre, ha a DNS a szemikonzervatív modell szerint replikálódott.

A DNS szintézis molekuláris mechanizmusa A genetikai információ továbbadását megelőző folyamat az örökítő anyag replikációja, melyet a repliszóma multiprotein komplex végez. A replikáció az élővilágban univerzálisan jellemző tulajdonságokkal bír: templátfüggő szemikonzervatív a nukleinsav polimerizáció 5’-3’ irányú a két DNS szál másolása összehangolt

4. A DNS szintézis molekuláris mechanizmusa általános áttekintés A DNS-polimeráz III enzim szintetizálja a templátszál alapján (a bázispárosodás szabálya szerint) az új komplementer szálat. A helikáz enzim a DNS két szálát választja szét. Vezető szál A primáz enzim szintetizálja minden Okazaki fragmentum elé az RNS primereket, hogy a DNS-polimeráz III ehhez a kettősszálú hibrid szakaszhoz kapcsolódva tudja elkezdeni a komplementer DNS szál szintézisét. A DNS-polimeráz I eltávolítja az RNS nukleotidokat (primer) és DNS nukleotidokat épít be helyettük, vagyis az RNS-re jellemző nukleotidok helyett (uracil) a DNS szálnak megfelelő timin bázisok épülnek be. alskjlskdf A DNS-polimeráz III szintetizálja a követő szálat is Okazaki fragmentumok formájában.

A replikációs villát a topoizomeráz és a helikáz enzimek hozzák létre. 5. A replikációs villa A replikációs villát a topoizomeráz és a helikáz enzimek hozzák létre. 4. A primáz (RNS-polimeráz) rövid RNS szálat szintetizál, az ún. primert, amely a DNS-templáttal komplementer. Erre azért van szükség, mert a DNS-polimeráz III csak duplaszálú nukleinsavhoz képes kötődni. 3. Az egyszálú DNS-hez kötődő fehérjék (ssb) feladata, hogy a szétválasztott szálakhoz kötődve megakadályozzák, hogy azok újra egymáshoz kapcsolódjanak. 1. A topoizomeráz enzim elvágja a DNS egyik szálát, így a feltorlódott feszültég miatt az ki tud tekeredni és csökken a DNS szuperhelikális szerkezete. A láncvégeket ezután foszfodiészter kötéssel egymáshoz kapcsolja a topoizomeráz. 2. A helikáz enzim szétválasztja a DNS két komplementer szálát egymástól.

A vezető szál szintézise folyamatosan történik az 5’- 3’ irányban. 1. Amint az RNS primer elkészült, a DNS-polimeráz III rá tud kapaszkodni a templátszálra és el tudja kezdeni a komplementer szál szintézisét. Ezt az ún. vezető szálat 5’— 3’ irányban folyamatosan tudja szintetizálni. A DNS-polimeráz III Nem ismeri fel az egyszálú DNS-t, szüksége van egy rövid, kettősszálú szakaszra (DNS-RNS hibrid). Csak 5’— 3’ irányban tudja a szintetizálódó szálat hosszabbítani, ugyanis csak a 3’ OH-csoporthoz tudja kapcsolni a következő nukleotidot. 2. A DNS-polimeráz III nukleotidról nukleotidra lépked a templátszálon, és a templátszál bázisainak megfelelően, az azokkal komplementer nukleotidokat beépíti az újonnan szintetizálódó szálba.

A polimeráz III csak 5’— 3’ irányban tudja beépíteni a komplementer nukleotidokat. A növekvő lánc 3’ OH vége A dezoxiribonukleozid-trifoszfát a DNS-polimeráz III szubsztrátja A DNS-polimeráz III a komplementer dezoxiribonukleozid-monofoszfátokat = nukleotid kapcsol foszfodiészter kötéssel a növekvő lánc 3’ OH végéhez. A reakció energiaigényét a pirofoszfát csoport leszakadásával felszabaduló energia szolgáltatja.

7. A követő szál A követő szál szintézise 5’— 3’ irányban csak Okazaki fragmentumok formájában lehetséges. Mivel a DNS két szála antiparallel lefutású, a másikat, az ún. követő szálat, csak a replikációs villa haladási irányával (a szintézis fő irányával) ellentétes irányban lehet kisebb szakaszokban, ún. Okazaki fragmentumok formájában szintetizálni. 2. A primáz minden Okazaki fragmentum elé egy primert kell hogy szintetizáljon, amihez a DNS-polimeráz III hozzá tud kapcsolódni. 3. A primáztól kapott kis segítséggel a DNS-polimeráz III a tőle megszokott rutinnal katalizálja a nukleotidok beépülését a komplementer láncba.

A követő szál szintézise… 1. Ahogy a polimeráz III eléri az előző primert, lekapcsolódik a DNS-ről. 2. Miután a következő primer is a helyére került, a polimeráz III ehhez is hozzá tud kapcsolódni és szintetizálja a következő Okazaki fragmentumot. 3. A DNS-polimeráz I feladata, hogy eltávolítsa az RNS primer nukleotidjait és DNS nukleotidokat építsen be, vagyis hogy egységes DNS szálat hozzon létre. 4. A DNS-ligáz enzim képes a komplementer szálba a már beépült és egymás mellé került két nukleotid között egy foszfodiészter kötést létesíteni. 5. A követő szálnak ez a szakasza most már teljesen elkészült.

A DNS-polimeráz III egy nagyméretű, két alegységből álló (dimer) holoenzim. 1. A DNS-polimeráz III dimér szerkezete azt jelenti, hogy az enzim két, a replikációs villában elhelyezkedő félből áll. Az egyik fél a vezető szál szintézisét végzi, míg a másik a követő szálat építi. A két szál szimultán szintézisét az antiparallel lefutásuk ellenére az teszi lehetővé, hogy a követő szál egy hurkot alkot. A hurok a képen látható módon lehetővé teszi, hogy mindkét szál 5’— 3’ irányban épüljön, miközben az enzim két fele egymás mellett helyezkedik el. 2. A DNS-polimeráz I eltávolítja az RNS primert és DNS-t szintetizál helyette. 3. A ligáz tudja összekapcsolni az egymás mellé került DNS láncvégeket.

8. A replikációs origó A replikációs origó szerkezete: a replikációs buborék két ellentétes irányban haladó replikációs villát tartalmaz. 3. Figyeljük meg, hogy ugyanaz a templátszál a replikációs origótól számítva az egyik irányban a vezető szál, a másik irányban a követő szál szintézisét irányítja. 2. Az így létrejövő egyre növekvő replikációs buborék két ellentétes irányban haladó replikációs villát tartalmaz. 1. A replikáció az ún. replikációs kezdő ponton (origó) indul el és két irányban halad. A replikációs origó adeninben és timinben gazdag, így a két szálat aránylag könnyű szétválasztani (csak két hidrogénkötés van köztük).

Prokarióta replikációs origó A prokarióta kromoszóma a replikáció alatt is megőrzi cirkuláris formáját. Egyetlen replikációs origóval rendelkezik és a replikáció mindig ezen a ponton kezdődik és két irányban halad. Az egész bakteriális DNS egy replikonnak tekinthető. Replikonnak nevezzük a külön replikációs origóval rendelkező és önálló replikációs egységként működő DNS molekulákat vagy szakaszokat. Amint a két replikációs villa ellentétes irányba halad, végül elérik egymást a cirkuláris DNS-en/genomon és két egymásba hurkolódó cirkuláris DNS keletkezik, melyeket egy enzim (DNS-topoizomeráz) választ szét.

Eukarióta replikációs origó Magasabb rendű szervezetekben a sejtek DNS tartalma kb. 1000-szerese annak, amennyi egy baktériumsejtben található. Emellett az eukarióta DNS-polimeráz sokkal lassabban szintetizálja a DNS-t, mint a prokarióta DNS-polimeráz. Ennek ellensúlyozására az eukarióta genom kis egységek, ún. replikonok, formájában szintetizálódik. Mindegyik replikon külön replikációs origóval rendelkezik, ahonnan a replikáció mindkét irányban halad. Egy emberi sejtben kb. 10 000-100 000 replikációs origó létezik, ahonnan megindul a replikáció. Emlős sejtekben a genomnak az a része, amely aktív (átíródó) géneket tartalmaz, korábban íródik át, mint az inaktív szakaszok. Az acetilált hiszton molekulák jelzik az aktív géneket, és egyben azt is, hogy a régió átírása hamarabb történik. A két replikációs villa közötti szétnyílt rész a replikációs buborék.

8. DNS-javító mechanizmusok A sejteknek alapvetően három típusú javító mechanizmus áll a rendelkezésére. Ezek nélkül minden 100 000-dik bázis (10-5) hibásan épülne be a DNS replikáció során, ami az élet jelenlegi formáival teljesen összeegyeztethetetlen lenne. Proofreading javítás: A DNS-polimeráz III enzim a saját maga által hibásan beépített nukleotidot kivágja (3’ — 5’ exonukleáz aktivitás) és a helyes nukleotidot építi be mielőtt tovább lép. A DNS-polimeráz III 3’ — 5’exonukleáz aktivitása tehát azt jelenti, hogy a láncvégi nukleotidot képes lehasítani, ha az nem komplementer a templát DNS szál megfelelő bázisával és a helyére egy komplementer bázisú nukleotidot épít be. A folyamat eredményeként már csak minden 10 000 000-ik bázispár hibás (10-7). Mismatch (hibás bázispárok) javítás: A javító enzim közvetlen a DNS szintézist követően ellenőrzi a DNS szálat és a DNS-polimeráz III által bent hagyott hibás bázispárokat (mismatch) javítja ki. Mielőtt azonban a hibás bázispárokat kijavítja, el kell dönteni, hogy melyik volt a régi szál, hogy az újat ahhoz képest tudja javítani. Pl. egy A — C hibás bázispárnál el kell dönteni, hogy az egyik szálban az adenint kell guaninra, vagy a másik szálban a citozint timinre cserélni. Ennek eldöntése nagyon egyszerű, ugyanis a régi szál metilált, vagyis bizonyos nukleotidokhoz metil(CH3)csoport kapcsolt. A replikációt követően a régi szál metilációs mintázata alapján az új szál is metilálódik,(a feladatot a fenntartó metiláz végzi) amikor is a javító enzim már nem tud különbséget tenni a régi és az új szálak között. Közvetlenül a replikáció után tehát azon a DNS szálon történik a javítás, amelyik nem metilált. A folyamat végére átlagosan már csak minden 100 milliárd bázispárból lesz egy hibás (10-11). Mivel az emberi genom 3 milliárd bázispárból áll, ez azt jelenti, hogy a replikáció során gyakorlatilag nem történt a bázissorrendben változás. Exciziós javítás/repair: Mutagén hatásokra a DNS-ben folyamatosan keletkeznek hibás vagy sérült nukleotidok, melyeket az exciziós javító enzimek fedeznek fel és javítanak ki.

DNA proofreading Mismatch repair Excision repair A polimeráz III a saját hibáját javítja (3’ — 5’ exonukleáz aktivitás), kivágja a hibás bázist. A polimeráz III beépíti a templátszálnak megfelelő nukleotidot a növekvő szálba és folytatja a szintézist. A DNS-polimeráz III egy rossz nukleotidot épít be az új szálba. Mismatch repair A DNS-polimeráz III proofreading javításából kimaradt hibás bázispár. A mismatch enzim kivágja a hibás nukleotidot néhány szomszédos nukleotiddal együtt. A DNS-polimeráz I beépíti a helyes bázisokat, a ligáz pedig összekapcsolja a szálvégeket. Excision repair A DNS-polimeráz I kitölti a rövid egyszálú szakaszt a helyes nukleotidokkal. Mutagén hatásra sérült nukleotid a DNS-ben. Az javító enzim a szomszédos nukleotidokkal együtt kivágja a sérült vagy hibás nukleotidokat.

A nukleotid exciziós javító mechanizmus kivágja az UV hatására keletkező timin diméreket. Timin dimér képződés UV hatására UV fény hatására két egymás melletti timin kovalens kötéssel összekapcsolódik, timin dimért képez és eltorzítja a DNS-t. Xeroderma pigmentózum A nukleotid exciziós repair enzim kivágja a hibás szakaszt. Az exciziós repair enzim örökletes hibája okozza az ismert xerodema pigmentosum bőrbetegséget. A betegségben szenvedők bőre fokozottan érzékeny a napra, ugyanis az UV hatására a bőr sejtjeiben keletkező mutációkat a hibás enzim nem tudja javítani. A DNS-polimeráz I a bázispárosodás szabályának megfelelően újra szintetizálja a kivágott szakaszt a hibátlan templátszál alapján. A ligáz enzim egymáshoz kapcsolja az új és régi szálak végeit.