A T sejtek érésének elsődleges szervei A T sejtek érésének elsődleges szervei. A T-sejt érés antigéntől független fázisai, a TCR gének átrendeződése. A T-sejt fejlődés elágazási pontjai és transzkripcionális szabályozásuk 2019. 03. 13.

A limfociták csontvelői pluripotens (PHSC) őssejtből keletkező limfoid előalakból származnak Differenciálódás Proliferáció Szelekció Fehérvérsejt: kb. 30% limfocita Összlimfocita: kb. 1012/felnőtt (humán) Új limfoid sejt: kb. ~108-109/nap ~1 milló érett T sejt/nap PHSC Az emberi vér limfocitáinak populáció megoszlása CD19+ B-sejt 72–460 sejt/μL 4.70–19.13% CD25+/FOXP3+ Treg sejt ~7% CD3+ T sejt 536–1787 sejt/μL 54.90–84.03% CD3−/CD16+/CD56+ NK-sejt 77–427 sejt/μL 5.35–30.93% CD4+ T sejt 32.53–62.88% CD4+ vagy CD8+ vagy DN/ CD56+/TCR + NKT sejt ~0.2% CD8+ T sejt 11.55–38.60% γδ TCR sejt 1-5%

A T-sejtek ontogenezise extra-tímusz érés? csontvelő tímusz periféria, nyirokszervek differenciálódás: pluripotens hematopoietikus őssejt (PHSC) közös limfoid progenitor (CLP) pro-T differenciálódás (DN, DP, SP timociták) proliferáció TCR gén-rekombináció tanulás/szelekció (pozitív és negatív) aktiváció proliferáció polarizáció (Th1/Th2/Th17/iTreg stb.) differenciáció (effektor, memória)

A T-sejtek migrációja primer migráció szekunder migráció TCR gén-rekombináció pozitív és negatív szelekció aktiváció patogén elimináció Fig. 8.14 T sejt undergo development in the thymus and migrate to the peripheral lymphoid organs, where they are activated by foreign antigens. T-cell precursors migrate from the marrow to the thymus, where the T-cell receptor genes are rearranged (firstPanels); a:� T-cell receptors that are compatible with self-MHC molecules transmit a survival signal on interactingwith thymic epithelium, leading to positive selection of the sejt that bear them. Self-reactive receptors transmit a signal that leads to cell death, and sejt bearingthem are removed from the repertoire in a process of negative selection (second panels). T sejt that survive selection mature and leave the thymus to circulate in the periphery; they repeatedly leave the blood to migrate through the peripheral lymphoid organs, where they may encounter their specific foreign antigen and become activated (third panels). Activation leads to clonal expansion and differentiation into effector T sejt. T heseare at tracted to sites of infection, where they can kill infected sejt or activate macrophages (fourth panels); others are attracted into 8-cell areas, where theyhelp to activate an antibody response (notshown). Janeway’s Immunobiology, 8th edition primer migráció szekunder migráció

A tímusz kialakulása az embrionális légúti szövetekből A 3. Garattasakból alakul ki (a, b) Később elválik a mellékpajzsmirigytől is (c, d) Transzkripciós faktorok szabályozzák az organogenezisét Az NCC sejtek segítik a növekedését, kifejlődését és a TEC differenciálódást a | Embryonic day 9.5 (E9.5): positioning. Paired box gene 1 (Pax1)/Pax9 and fibroblast growth factor 8 (Fgf8; green) are required for pharyngeal pouch formation. Homeobox A3 (Hoxa3; red) is required for third pouch (p3) axial identity, possibly through the Pax–Eya–Six cascade. b | E11: initiation. Rudiment outgrowth begins at this stage. The Hox–Pax–Eya–Six cascade is required in the endoderm (yellow); Hoxa3 and Eya1 might also be required in neural crest sejt (NCCs). c | E11.5–E12.5: outgrowth and patterning of the rudiment. Regionalization of the rudiment into thymus- and parathyroid-specific domains. This patterning actually begins at E10 with the expression of glial sejt missing homologue 2 (Gcm2; red) in the third pouch, controlled at least in part by the Hox–Pax–Eya–Six cascade. High-level expression of forkhead box N1 (Foxn1; blue) begins at E11.25. Lymphoid progenitors (not shown) also begin to arrive at this time, entering the thymus through the capsule by a chemoattractive mechanism. d | E12–E13.5: separation from the pharynx and migration of the rudiment. Pax9 is required for separation from the pharynx. Migration might be controlled by Hox3 genes expressed by NCCs. Separation of the parathyroid from the thymus might be regulated by Gcm2. e | E12–birth: differentiation. Foxn1 is required for the generation of all thymic epithelial-cell (TEC) subtypes — cortical and medullary. Initial differentiation is thymocyte independent. Final differentiation requires thymocyte-derived signals, and depends on the Foxn1 amino-terminal domain (Foxn1 ). Wnt signalling (through the regulation of Foxn1 ) has been implicated in both autocrine- (TEC–TEC) and paracrine- (TEC–thymocyte) mediated differentiation. The NCC mesenchyme (not shown) might support growth and differentiation of TECs, possibly through fibroblast growth factors, whereas a lymphotoxin-receptor-dependent signalling pathway seems to control late-stage differentiation and maintenance of medullary TECs. Eya1, eyes absent 1 homologue; Six1, sine oculis-related homeobox 1 homologue. Blackburn et al, Nature Reviews Immunology 4, 278-289 (2004) Velőcső sejtek (NCC)

Tímusz involúció és öregedés 20 éves korban a tímusz térfogatának > 80%-a limfoid szövet 40 éves korra ≈5%-ra csökken Nemi hormonok szerepe Tímusz regenerációt segítő faktorok edulla ortex Thymic function decreases with age. (a) Top panel shows cytokeratin-immunostained and hematoxylin & eosin (H&E)-counterstained thymus sections from healthy young and aged human donors. In the aged thymus, the perivascular space (P) is increased in size and the thymopoietic cortex (C) and medulla (M) are significantly constricted. Lower panel shows flow cytometric analysis of CD4 and CD8 on thymocytes isolated from healthy young and aged human thymus donors; a clear reduction in double positive (DP) CD4+CD8+ T sejt be seen in aged individuals. Factors involved in thymic involution and reconstitution. Young thymus produces self-tolerant T sejt expressing a broad T-cell receptor (TCR) repertoire, and this is supported in a well-delineated cortex and medulla by functionally distinct stromal cell populations. With age, there is a gradual reduction in total thymic cellularity, an increase in perivascular space (PVS), disruption of the thymic architecture, a reduced production of naïve T sejt and a restriction in the peripheral TCR repertoire. Involution of the thymus occurs in parallel with increased production of sex steroids in humans. Treatment with thymostimulatory cytokines, such as keratinocyte growth factor (KGF), interleukin 7 (IL-7), growth hormone (GH), leptin and ghrelin, or sex steroid ablation therapy (SSA), can promote regeneration of an atrophic thymus—increasing total cellularity, restoring thymic architecture, increasing output of naïve T sejt and rejuvenating the diversity of the peripheral TCR repertoire. This might occur by several mechanisms including an increase in thymus seeding by early T-lineage progenitors (ETPs) or increased proliferation and/or differentiation of triple negative (TN), double positive (DP) or single positive (SP) thymocytes. eri-vascular space Nemi hormon megvonás terápia (SSA) keratinocita növekedési faktor (KGF) Interleukin-7 (IL-7) növekedési hormon (GH) http://natcellthymus.com/Thymic-involution_immune-reconstitution.html

A tímusz és az immunfunkció vizsgálati eszköz: neonatális thymectómia (sebészeti úton) vagy FTOC (fetális tímusz szövetkultúra), transzgén/knockout egerek vagy congenitális születési defektus (tímusz kifejlődési rendellenesség) humán: DiGeorge szindróma (22q11 deléció – TBX1 gén deletálódik) egér: ‘nude’ egér (FOXN1 gén mutáció)  A keringésből hiányzanak az érett, válaszképes T sejtek és a sejt-közvetített immunválasz a tímusz átlagos súlya kb. 30-40 g a pubertás befejeztéig, majd atrophizál  felnőtt egyedekben kb. 10 g ‘kortikoszteroidok’ szerepe  kortikális éretlen timociták magas érzékenységet mutatnak, míg az érett timociták nem az öregedéssel a tímusz funkciója fokozatosan lecsökken (csak kvantitatív alapon?!)  hozzájárul a szervezet immunfunkciójának intenzitáscsökkenéséhez

A tímusz epitél sejtek (TEC) fejlődése Bipotent thymic epithelial cell (TEC) progenitors develop from the endoderm of the third pharyngeal pouch; these sejt express the transcription factor forkhead box protein N1 (FOXN1). There have been attempts to derive this cell type using the in vitro differentiation of embryonic stem and induced pluripotent stem (iPS) sejt. The bipotent progenitors are thought to give rise to mature cortical TECs (cTECs) and medullary TECs (mTECs) via compartment-specific progenitor sejt. cTEC-like environments have been generated by transgenic reprogramming in vivo and in vitro using specific factors, for example, the Notch ligand 1 delta-like ligand 4 (DLL4) and CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12); generation of mTEC-like environments from non-cognate sources, for example, by the expression of lymphotoxin-β receptor (LTβR), RANK ligand (RANKL) and CD40 ligand (CD40L), has not yet been reported. FOXN1 expresszió (eltérő expressziós szintek a különböző stádiumokban) Notch ligand 1 delta-like ligand 4 (DLL4 Indukált pluripotens őssejt (iPS) Boehm et al, Nature Reviews Immunology, 13, 831–838 (2013)

A tímusz epitél sejtek jellemzése Az endodermából származnak Megtalálhatók a tímusz kérgi (cortex) és velő (medulla) állományában egyaránt Heterogének (cTEC és mTEC alpopulációk; ellenanyag festődés és ultrastruktúrális morfológia alapján) Egymáshoz „desmosomákon” kapcsolódnak Az epitél-retikuláris sejt alcsoportjuk részét képezi a vér-tímusz barrier-nek , de a timocita fejlődésben (citokinek szekréciója) és a timusz hormonális szabályozásában (thymopoietin szekréció) is fontosak Degenerációjuk Hassall féle korpuszkulák képződéséhez vezet a „velő” állományban: apoptotikus törmelékek tárolása; TSLP szekréció  DC alcsoport aktiváció  Treg fejlődés? a: epitél-retikuláris sejt b: limfociták c: desmosoma

Vér-tímusz barrier A „barrier” komponensei: Endotél sejtek citoplazmája Az endotélium bazális laminája Sejtközi tér Az epitél - retikuláris sejtek bazális laminája Az epitél - retikuláris sejtek citoplazmája Cél: a tímusz védelme az idegen antigénekkel való korai találkozástól!

A tímusz (humán) sejtes organizációja TEC-ek körülveszik a fejlődő timocitákat Intenzív timocita apoptózis a coretxben (Mf-ok kebelezik be) Hassall’s corpuscle Fig. 8.15 The cellular organization of the human thymus. The thymus, which lies in the midline of the body, above the heart, along with macrophages (yellow) and dendritic sejt (yellow) of bone marrow origin. Hassall's corpuscles are probably also sites of cell destruction. The thymocytes in the outer cortical cell layer are proliferating immature sejt, whereas the deeper cortical thymocytes are mainly immature T sejt undergoing thymic selection. The photograph shows the equivalent section of a human thymus, stained with hematoxylin and eosin. The cortex is darkly staining, whereas the medulla is lightly stained. The large body in the medulla is a Hassall's corpuscle. Photograph courtesy of C.J. Howe. is made up of several lobules, each of which contains discrete cortical (outer) and medullary (central) regions. As shown in the diagram on the left, the cortex consists of immature thymocytes (dark blue), branched cortical epithelial sejt (pale blue), with which the immature cortical thymocytes are closely associated, and scattered macrophages (yellow), which are involved in clearing apoptotic thymocytes. The medulla consists of mature thymocytes (dark blue) and medullary epithelial sejt (orange), Fig. 8.16 The epithelial sejt of the thymus form a network surrounding developing thymocytes. In this scanning electron micrograph of the thymus, the developing thymocytes (the spherical sejt) occupy the interstices of an extensive network of epithelial sejt. Photograph courtesy of W. van Ewijk. Fig. 8.18 Developing T sejt that undergo apoptosis are ingested by macrophages in the thymic cortex. Panel a shows a section through the thymic cortex and part of the medulla in which sejt have been stained for apoptosis with a red dye. Thymic cortex is to the right of the photograph. Apoptotic sejt are scattered throughout the cortex but are rare in the medulla. Panel b shows a section of thymic cortex at higher magnification that has been stained red for apoptotic sejt and blue for macrophages. The apoptotic sejt can be seen within macrophages. Magnifications: panel a,x45; panel b,x164. Photographs courtesy of J. Sprent and C. Surh. Janeway’s Immunobiology, 8th edition

A T sejt érés és a tímusz mikrokörnyezet kapcsolata csontvelő tímusz T/NK progenitor CLP primer migráció a sztróma: epitél sejtek (cTEC, mTEC), „dajka” sejtek (sepciális cTEC?), fibroblasztok, egyéb, “extra-tímusz” sejtek (DC, Mf) sejt-sejt és sejt-ECM kölcsönhatások szolubilis mediátorok (pl. IL-6, IL-7, TSLP, GC, SCF) neuroendokrin szabályozás az MHC-korlátozás és a TcR-hoz kapcsolt szelekció

A T-sejtek ontogenezisének szabályozása stádium/sejtvonal-függő sejtfelszíni receptor/koreceptor gének aktivációja intracelluláris jelátviteli molekulák nukleáris transzkripciós faktorok tímusz eredetű citokin-profil, extracelluláris adenozin, ADP, ATP (purinerg szabályozás) extratímusz tényezők (pl. stressz; nervális/szimpatikus β- adrenerg, kolinerg szabályozás; glukokortikoidok) A T-sejt fejlődés több szinten is regulált

A tímusz mikrokörnyezet az érés különböző fázisaiban: Az érés fenotipikus jellemzői cKit+ tok alatti régió TN, éretlen, CD3- CD4- CD8- timociták CD44+ CD25- CD44+ CD25+ CD44low CD25+ β- láncR kortex DP, éretlen, CD3+ timociták kortiko-medulláris junctio Committed lymphoid progenitors arise in the bone marrow and migrate to the thymus. Early committed T sejt lack expression of T-cell receptor (TCR), CD4 and CD8, and are termed double-negative (DN; no CD4 or CD8) thymocytes. DN thymocytes can be further subdivided into four stages of differentiation (DN1, CD44+CD25-; DN2, CD44+CD25+; DN3, CD44-CD25+; and DN4, CD44-CD25-)41. As sejt progress through the DN2 to DN4 stages, they express the pre-TCR, which is composed of the non-rearranging pre-T  chain and a rearranged TCR  -chain43. Successful pre-TCR expression leads to substantial cell proliferation during the DN4 to double positive (DP) transition and replacement of the pre-TCR  -chain with a newly rearranged TCR  -chain, which yields a complete  TCR. The  -TCR+CD4+CD8+ (DP) thymocytes then interact with cortical epithelial sejt that express a high density of MHC class I and class II molecules associated with self-peptides. The fate of the DP thymocytes depends on signalling that is mediated by interaction of the TCR with these self-peptide–MHC ligands6, 51. Too little signalling results in delayed apoptosis (death by neglect). Too much signalling can promote acute apoptosis (negative selection); this is most common in the medulla on encounter with strongly activating self-ligands on haematopoietic sejt, particularly dendritic sejt123. The appropriate, intermediate level of TCR signalling initiates effective maturation (positive selection). Thymocytes that express TCRs that bind self-peptide–MHC-class-I complexes become CD8+ T sejt, whereas those that express TCRs that bind self-peptide–MHC-class-II ligands become CD4+ T sejt; these sejt are then ready for export from the medulla to peripheral lymphoid sites. SP, single positive. CD44- CD25- pTα/β CD3low CD4+ CD8+ pTα/β CD3low CD4+CD8+ Tα/β CD3low medulla SP, érett, CD3+ “naív” T limfociták CD8+ Tα/β CD3 CD4+ Tα/β CD3

1988- : a T-sejt fejlődés transzkripcionális regulációja: az első TF családok azonosítása pl. Ikaros, LKLF, GATA zinc-finger, Ets, HMG-box, CREB/ATF, NF-κB/ Rel/NFAT, STAT Szabályozzák: T sejt fejlődés elágazásai/sejt- átmenetek, differenciálódás T sejt növekedés, proliferáció T-sejtek nyugvó – aktivált állapotainak egyensúlya T-sejt túlélés/sejthalál Nagy TF komplexek http://www.nature.com/scitable/content/transcription-is-initiated-at-rna-polymerase-ii-18943

A T-sejt fejlődés elágazási pontjai: a CLP, a B, az NK, a gdT/ab T, valamint az NKT sejtfejlődési vonalak szétválása T-sejt SP CD4+ PHSC B sejt GATA-3, ThPOK T-sejt SP CD8+ Ikaros, Pu.1 NK sejt ITK, RLK CLP IL7R+ Thy-1- c-kitlo Pax5 T-sejt DP Ets 1 T-sejt SP Treg FOXP3 T/NK sejt progenitor Notch RUNX1 T-sejt DN NKT-sejt γδT-sejt GATA-3 Plaszticitás, heterogenitás? Transzkripciós faktorok szabályozzák SOX-13

A tímusz mikrokörnyezet az érés különböző fázisaiban: Az érés részfolyamatai, sejtes és szolubilis mediátorai Intenzív proliferáció/differenciálódás: FN (ECM) – CD44 (homing, túlélés, prolif.) IL-2 (autokrin) – CD25 (IL-2Rα) (proliferáció) IL-6 (TEC) – IL-6R (proliferáció) IL-7 (TEC) – IL-7Rα+γ (túlélés, differenciáció, proliferáció) TSLP (TEC) – TSLPR +IL-7R α (IL-7-hez hasonló hatások) SCF – c-kit (progenitor túlélés, differenciáció) tok alatti régió TcR gén átrendeződés (RAG gének): IL-7 (TEC) – IL7Rα+γ (DNS demetilácó, hiszton acetiláció) kortex kortiko- medulláris junction medulla Tanulás/szelekció/centrális tolarencia: MHC/p (TEC, DC, Mf)- TCR, CD4, CD8 (+ / – szel.) IL-7 (TEC) – IL7Rα+γ (+ szelekció után túlélés) out Fibronectin (FN) Extracelluláris mátrix (ECM) kérgi hám/epitél/stróma sejtek makrofág (csontvelőből, keringésből) kortikális/medulláris epitél sejtek dendritikus sejt (csontvelőből) timociták

A timociták irányított migrációjuk során végig szoros kontaktusban vannak a tímusz epitél sejtekkel Adhéziós molekulák Kemokinek Kemokin receptorok a | In the postnatal thymus, circulating T-lymphoid progenitor sejt migrate into the thymic parenchyma through the vasculatures that are enriched around the cortico–medullary junction. b | The outward migration of CD4-CD8- double-negative (DN) thymocytes to the capsule is regulated by chemokine signals through CXC-chemokine receptor 4 (CXCR4) and CC-chemokine receptor 7 (CCR7). c | Further outward migration of the DN thymocytes to the subcapsular region is mediated by CCR9 signals. d | CD4+CD8+ double-positive (DP) thymocytes generated in the outer cortex are motile, interacting with stromal sejt that are localized in the cortex for positive and negative selection. e | Positively selected DP thymocytes that gain the capability to survive and differentiate into CD4 or CD8 single-positive (SP) thymocytes show an increase in the surface expression of CCR7, through which the sejt are attracted to the medulla, which expresses CCR7 ligands. f | In the medulla, further selection of SP thymocytes includes the deletion of tissue-specific-antigen-reactive T sejt and the generation of regulatory T sejt. g | Mature SP thymocytes express sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1P1), through which the sejt are attracted back to the circulation that contains a high concentration of sphingosine-1-phosphate. cTEC, cortical thymic epithelial cell; DC, dendritic cell; mTEC, medullary thymic epithelial cell; PSGL1, platelet-selectin glycoprotein ligand 1. Nature Reviews Immunology 6, 127-135 (February 2006) Takahama, Nature Reviews Immunology, 6, 127–135 (2006) sphingosine-1-phosphate (S1P)

Kemokinek és kemokin receptorok a tímuszban Takahama Nature Reviews Immunology 6, 127–135 (2006)

A Limfo-sztrómális interakciók szerepe a T sejt fejdődésben Figure 2 | Lympho–stromal interactions underlying T cell development. a | A representation of T cell development is depicted as a succession of distinct lympho–stromal interactions. Boehm et al, Nature Reviews Immunology, 13, 831–838 (2013) A tímusz megfelelő vaszkularizációja  be/kilépési pont a T-sejt progenitoroknak és az érett T sejteknek A kortikális és medulláris régiók anatómiai szegregációja és érés specifikus nich-ek a sztróma mikrokörnyezetben  az adott timocita fejlődési stádiumnak megfelelő sejt-sejt kontaktus és szolubilis faktor „készlet”

Az MHC-korlátozott szelekciós folyamatok a tímuszban meghatározzák a ko-receptor specificitást is TCR MHC I-re (bal) vagy MHC II-re (jobb) korlátozott TCR- transzgén egerekben csak CD8+ (bal) vagy CD4+ (jobb) sejtek értek be Fig. 8.30 The MHC molecules that induce positive selection determine co-receptor specificity. In mice transgenic forT-cell receptors restricted by an MHC class I molecule (top panel), the mature T sejt that develop all have the CDS (red) phenotype. In mice transgenic for receptors restricted by an MHC class II molecule (bottom panel), all mature T sejt have the CD4 (blue) phenotype. In both cases, normal numbers of immature, double-positive thymocytes (half blue, half red) are found. T he specificity of the T-cell receptor determines the outcome of the developmental pathway, ensuring that the only T sejt that mature are those equipped with a co-receptor that is able to bind the same self-MHC molecule as the T-cell receptor. Janeway’s Immunobiology, 8th edition

Az antigének szerepe a negatív szelekcióban és a centrális tolarenciában Antigén szóródás Promiscuously expressed tissue-restricted antigens (TRAs) gain access to both the MHC class I and the MHC class II pathways of medullary thymic epithelial cells (mTECs), whereby macroautophagy may enhance the loading of endogenous antigens onto MHC class II molecules. At the same time, mTECs are inefficient at presenting exogenous antigens. mTEC-derived antigens can also be transferred to and presented by conventional dendritic cells (cDCs) in the thymus. Depending on the nature of the respective self antigen, it is conceivable that TRAs are released or shed in soluble form to be subsequently captured and processed by cDCs for presentation on MHC class I or MHC class II molecules. In addition, apoptosis of terminally differentiated mTECs may lead to the release of apoptotic fragments that can also transfer mTEC-derived self antigens to cDCs for cross-presentation, a process presumably enhanced by the pro-apoptotic function of autoimmune regulator (AIRE). In addition, functional peptide–MHC complexes are unidirectionally translocated from mTECs to cDCs; however, the mechanistic details remain unclear. In contrast to mTECs, thymic cDCs efficiently present blood-borne antigens that reach the thymus through the circulation. It is assumed that autochthonous CD172a- cDCs (that is, cDCs of intrathymic origin) are the preferred recipients of mTEC-derived antigens, as depicted here. We think this is likely because migratory CD172a+ cDCs undergo further maturation on reaching the thymic microenvironment, suggesting that, akin to what has been described for mature, tissue-derived DCs in secondary lymphoid organs, they may 'freeze' their peripherally imprinted cargo of MHC ligands. In addition to tissue-specific peripheral self antigens, the antigens captured and processed by migratory cDCs before their relocation to the medulla may also encompass non-self antigens derived from innocuous foreign sources such as commensal bacteria or food. Klein et al, Nature Reviews Immunology, 9, 833–844 (2009) A medullában található különvöző sejtek (mTEC, DC alpopulációk, Mf) más-más antigéneket mutatanak be DP timocitáknak, így elétrőképpen járulnak hozzá a negatív szelekcióhoz Szövet-korlátozott antigén (TRA) Autoimmune regulator (AIRE)

A TCR affinitás és a timikus szelekció kapcsolata DMP004F2: Treg cells are selected in the thymus when the avidity of their TCR for self-MHC is lower than the threshold for negative selection by apoptosis, but higher than the threshold for positive selection of effector T cells. Mentions: The generation of natural Treg cells in the thymus is believed to occur as the result of an altered negative selection process. Commitment of naive T-cells to Treg cell differentiation is thought to result when their TCR/antigen affinity is just weaker that that needed for negative selection, but at the extremity of the spectrum for positive selection (Jordan et al., 2001) (Fig. 2). In other words, Treg cells derived from the thymus are selected largely on the basis of their capacity to interact with self-antigens, and this interaction is implicit in their role for protection against pathological self-reactive immune responses. Thymic-generated Treg cells are thus thought to function primarily in protection from a range of autoimmune diseases (reviewed in Sakaguchi, 2005). http://openi.nlm.nih.gov/detailedresult.php?img=2725755_dmp00402&req=4

Konklúzió Az MHC-I és MHC-II molekulák (és haplotípusuk), valamint a hozzájuk kötött peptidek is alapvetően meghatározzák a szelekciós folyamatok során kialakuló a T sejt-készlet nagyságát és összetételét (pl. CD4+:CD8+ arány)

Animációk http://www.youtube.com/watch?v=9E_UxnC_L2o http://www.bio.davidson.edu/Immunology/Flash/Main.html http://www.youtube.com/watch?v=odLLr6mjaUQ

● A T sejtek ontogenezise: az antigén-független fázis ● A TCR génátrendeződés: a diverzitás kialakulása

A T-sejt érés és szabályozásának vizsgálati stratégiái Gén-manipulált állat (egér) modellek  A timusz szelekciós és egyéb T sejt fejlődési folyamatainak követése normál sejteken nehéz: a TcR-ok kis %-a reagál csak egy ‘különleges’ MHC/peptid komplex’-el 1.) “TcR transzgén” egerek - szelektivitás egér embrióba funkcionálisan átrendeződött TcR αβ géneket juttatnak, melyek adott MHC és antigén-peptid specificitással rendelkeznek 2.) Gén knockout, mutáns egerek adott gének célzott kiütése (KO) vagy domináns negatív mutációja (DN) rekombinációs gének: RAG-1/ RAG-2 -/- sejtfelszíni receptor gének: MHC-I, MHC-II, TcR, CD4, CD8, stb... szignál molekula / TRF gének: pl.Lck, Fyn, ZAP70, JAK-3, Ikarosz, stb...

3.) Speciális kiméra egerek valamely gén hiányzik (KO) - egy transzgén (Trg) expresszálva van Transzgén egerek x tenyésztése knockout vonalakkal és az utódok genetikai jellemzők alapján történő szelektálása pl. TcR transzgén egér valamilyen gén knockout háttérrel: β2m-deficiens, adott MHC-I-re korlátozott TcR-transzgén egér

Tímusz szubkapszuláris/ kortikális zóna TN1/TLP CLP GATA-3 Notch-1 PHSC PU.1 Ikaros TN1/TLP CLP CLP GATA-3 Notch-1 Pax5 IL-7Rα B sejt Tímusz

• • • A PHSC CLP elkötelezettséget szabályozó Ikaros TRF Limfoid sejt-specifikus, “Zinc-finger” típusú transzkripciós faktor családot kódol (6 izoforma ismert) • Az izoformák: 1 azonos C terminális domén és 2 zinc-finger dimerizációs domén (4 zinc-finger DNS-kötő domén kombinációjából) csak az 1, 2, 3 izoformák kötődnek egy konszenzus GGGA DNS core motívumhoz • Az Ikaros széles expressziós mintázatot mutat: peteburok (E8), magzati és felnőtt timociták, érett T és B sejtek, NK sejtek

• • • Az Ikaros TRF T-sejt érést szabályozó hatásai: a DNS-kötő 1-3 zinc-finger régió célzott delétiója, vagy az Ikaros mutációja: • hiányoznak a T, B és NK sejtek, valamint ezek progenitorai ! • egyéb hematopoietikus fejlődési vonalak változatlanok • egy stabil negatív Ikaros forma expresszálódik, mely képes egyéb Ikaros-rokon fehérjékkel ( pl. Aiolos) dimerizálódni, de nem képes a DNS-hez kötődni !! Az Ikaros expressziója ill. aktív funkciója alapvetően fontos a CLP differenciálódásában és túlélésében Az Ikaros gén a limfoid sejtfejlődési vonal egyik legkorábbi transzkripciós szintű ellenőrzési pontja

• • • GATA-3: csak T és NK sejteken található ! A GATA-3 TRF a CLP-TN1 átmenet egyik legfontosabb szabályozója • A GATA család 6 tagból áll, melyek egy nagyon hasonló, 2 evolúciósan konzervált Zinc-finger doménből felépülő DNS-kötő domént tartalmaznak. A GATA fehérjék kötődnek konszenzus GATA szekvenciához és nem-konszenzus GATA motívumokhoz egyaránt GATA- 1,2,3 alcsalád GATA- 4,5,6 alcsalád hematopoietikus sejtek széles körén expresszált fejlődő szív, bélrendszer, sima izom GATA-1 : erythroid differenciálódás GATA-2: PHSC fejlődés/túlélés GATA-3: T sejt fejlődés GATA-3: • csak T és NK sejteken található ! • konszenzus GATA-3 kötőhelyek: TcR α, β, δ gének, CD8α gén

A GATA-3 gén szerepének igazolása: RAG2 komplementációs rendszer és GATA-3-/ - embrionális őssejtek kombinációja • RAG2 -/- egér GATA-3 -/- embrionális őssejt (ESC) • kiméra egér RAG2 -/ - blasztocisztába GATA-3 -/ - ESC injektálva mivel a B és T sejtek RAG nélkül nem fejlődnek, így a kiméra egérben az összes B és T sejt GATA-3 deficiens ES sejtből származik •

A GATA-3 gén szerepe II.  - a kiméra egérben normál B sejt populáció jelent meg - a tímuszból hiányoztak a DP és SP T sejtek és az érett perifériás T sejtek is a nyirokszervekből A GATA-3 esszenciális a TN/DP timociták kifejlődéséhez és túléléséhez A GATA-3 a T-sejt irányba elkötelezett sejtek fejlődésének legkorábbi transzkripciós szabályozó faktora

γδ T-sejtek A TN1-TN3 fejlődési állapotok és szabályozásuk… TN1/TLP TN2/pro-T TN3/pre-T IL-7, IL-7Rα E2A Hes1, HEB RAG 1,2 CD25 – CD44 ++ CD25 + CD44 + CD25 + CD44 - TcRβ, pTcRα Tímusz SCF, IL-7 (target: TcRγ gén) TSLP citokin E2A (Id) TRF-ok β (α) génátrendeződés

TN1- TN2 – TN3 – TN4 – ISP - DP E2A (Id) HEB γ,δ génátrendeződés és expresszió kontrollja pre-TcRα gén expresszió kontrollja • E2A -/- Erőteljes γδ-T-sejt hiány (20-40x), 5x αβ-T-sejt hiány HEB -/- nincs γδ-T-sejt hiány, 5-10x αβ-T-sejt hiány Az E2A a T-sejt érés γδ-T-sejt vonalának egyik specifikus szabályozója

 E és Id transzkripciós faktorok szabályozó funkciója a TN T-sejt érési fázisokban “helix-loop-helix” (HLH) család transzkripciós faktorok: E2A, HEB E-box: CD4-, TcRβ-enhancerek, CD4-silencer Id géntermékek: az E-proteinek DNS-kötését regulálják, gátolván az E-protein aktivitást, saját DNS kötőhelyük nincs T sejt-specifikus gén E protein: dimerizáció E-box aktivált transzkripció E- Id heterodimer: gátolt transzkripció Az Id3 az E2A/HEB DNS kötésének down-regulációja révén szabályozza az SP T sejtek termelődését a tímuszban.  E2A -/- egerek (HEB -/-) - A timocita érés részleges blokkja DN fázisban - DP timociták

lefolyása, főbb mechanizmusai A TCR láncok génjeinek átrendeződése: A szomatikus génrekombináció lefolyása, főbb mechanizmusai

A T sejtek érése

A T sejtek antigénfelismerő receptorának (TcR) szerkezeti felépítése (humán) 45-60 kD 40-60 kD jelátvitel, a komplex stabilitása (γ) (δ) felismerés CD3 α β v v CD3 δ ε γ ε c c ζ ζ s-s S-S jelátvitel (internalizáció) 25-28 kD, ser-P 20 kD, ser-P 20 kD, ser-P ITAM 20 kD, ser-P 16 kD, tyr-P humán 9., egér 11. kromoszómán

Az emberi TCR antigénkötő láncait kódoló gének V,J,D és C gén- szegmentumok lokusz: 50 –100 V,1 D, 6 J, 1 C gén 75 V, 60 J gén között: δ lokusz

RAG1 és RAG2 enzimek szerepe a génátrendeződésben Minden rekombinálódó V, D és J génszegmentumot nem kódoló régiók határolnak: ezek egy konzervált heptamérből és nonamerből állnak, melyeket egy 12 vagy 23 bázispárból álló spacer választ el egymástól ezek a Rekombinációs Szignál Szekvenciák (RSS), ezekhez kötődnek a RAG1,2 enzimek „coding joint” (kódoló szakasz) „signal-joint”

A „kapcsolódási diverzitás” kialakulása és a főszereplők: 1.) RSS- RAG1/2 kapcsolódás és hasítások, a ‘hairpin-loop’ kialakulása 2.) DNA-PK (DNS függő protein kináz) kapcsolódása a hasított végekhez és repair enzimek (Artemis nukleáz; XRCC4 (X-ray repair crosscomplementing factor4); Cernunnos DNA polymerase, ...) foszforiláció-függő toborzása a kapcsolódási helyekhez. 3.) A repair enzimek a DNA-PK segítségével „összeillesztik a két DNS szálvéget, P-nukleotid addíció, és ide toborozzák a TdT-t (terminális dezoxinukleotidil transzferázt), mely random N-nukleotid addíciót hajt végre. 4.) Végül a DNS ligázok fejezik be a kapcsolat kialakítást a kódoló (V)DJ joint géntermékben.

TCR α és TCR β láncok szomatikus génrekombinációja és processzálása teljes génkészlet: 1015 effektív gén -termékkészlet: ~107-108 DIVERZITÁS!