KÖRNYEZETVÉDELMI BIOTECHNOLÓGIA BIODEGRADÁCIÓ, BIOREMEDIÁCIÓ A környezet alkotó elemei egymással szoros összefüggésben léteznek, az egyes elemekre ható ártalmak a környezet egészére kihatnak. Ha a fennálló egyensúlyt megbontjuk, beláthatatlan környezetvédelmi problémákkal találhatjuk szembe magunkat. Fejlődő ipar felhalmozódó hulladék veszélyes anyagok   A Föld mikroflórájának válasza az újonnan megjelenő anyagokra adaptáció

Alapfogalmak biotechnológia “biotechnologie - (EREKY Károly, 1917) all work by which products are produced from raw materials with the help of living organisms” [Ereky] biokonverzió, biotranszformáció - különböző vegyületek mikrobiális átalakítása biodegradáció - szervesanyagok lebontása mikrobiális úton bioremediáció (= tisztítás, gyógyítás) - a környezet megtisztítása a toxikus hulladékoktól mikrobiális módszerekkel környezetvédelem (RRR: reuse, reduce, recycle) - megelőzés - tervszerű környezetfejlesztés - környezetünk megóvása, védelme

A mikrobiális eljárásokhoz ritkán alkalmaznak vad típusú törzseket molekuláris biotechnológia Mikroorganizmusok felszaporítása fermentorokban (cm3 m3) Mit tudnak a mikroorganizmusok? a legkülönbözőbb szerves vegyületek átalakítására képesek enzimek konstitutív indukált

„SUPERBUG” (1970s, Chakrabarty et al „SUPERBUG” (1970s, Chakrabarty et al.) new strain of bacterium Pseudomonas by manipulations of plasmid transfer CAM plasmid OCT plasmid Mating Strain A Strain B XYL plasmid NAH plasmid Mating Strain D Strain C Plasmid recombination XYL plasmid NAH plasmid Strain F CAM/OCT plasmid Strain E Mating XYL plasmid NAH plasmid CAM/OCT plasmid Strain G

Bioremediáció Előnye: - a terület megtisztul a szennyezőanyagoktól (ha biodegradáció, akkor ált. veszélytelen anyagokká alakulnak) - olcsóbb, mint a legtöbb fizikai, kémiai eljárás Hátránya: - rossz hatékonyságú lehet pl. összetett-, vagy nehezen hozzáférhető szennyezések esetén - talaj humuszanyagait is bonthatják a mikroorganizmusok Megoldás lehet a fizikai, kémiai és biológiai módszerek kombinálása.

A szennyeződések kimutatására alkalmazott módszerek Talajok, vizek minőségének meghatározása fizikai, kémiai, biológai vizsgálatok elvégzéséből és kielemzéséből áll. Gyakran igen sokféle szerves anyagot tartalmaznak, melyek egyenkénti mennyiségi meghatározása (sőt kimutatása is) rendkívül körülményes. BOI: az az oxigénmennyiség, mely a vízben lévő szerves anyagok aerob úton meghatározott idő alatt történő biokémiai lebontása során elfogy   KOI: a vízminta K-permanganáttal vagy K-dikromáttal történő (egyórás) forralása során elhasználódott vegyszerrel egyenértékű oxigén fogyással jellemeznek További fontos minőségmeghatározási paraméterek: nitrogén-, foszfor-, szerves- és összes széntartalom, pH, hőmérséklet, talaj porozitása

A biológiai oxigénigény mérése (BOI5) Speciális üvegekben, 5 napig, állandó hőmérsékleten kevertetve Mérőfej napi egy mérést végez 5x NaOH szükséges a CO2 megkötésére Gyakorlaton szennyezett talaj, vagy szennyvíz minta szervesanyagainak bonthatóságát vizsgáljuk e módszerrel (a minták hígításához használt tápoldat szervetlen sókat tartalmaz, pl. foszfát, klorid, szulfát, nitrát): a végtérfogat 97 ml „negatív kontroll” – csak 10% (w/v) talajt tartalmaz 10% (w/v) talaj, 5% előnövesztett baktérium 1 kultúra 10% (w/v) talaj, 5% előnövesztett baktérium 2 kultúra 10% (w/v) talaj, 5% előnövesztett baktérium 3 kultúra 10% (w/v) talaj, 5% előnövesztett baktérium 4 kultúra 10% (w/v) talaj, 5% előnövesztett baktérium 5 kultúra „pozitív kontroll” - 10% (w/v) talaj, 5% előnövesztett baktérium 1 kultúra LB tápoldatban, baktérium által felhasználható szubsztrát (LB: könnyen hasznosítható szervesanyagokat, pl. aminosavakat, vitaminokat, nyomelemeket tartalmaz)

XENOS = IDEGEN NEM TERMÉSZETES EREDETŰ (SZINTETIKUS) Xenobiotikumok XENOS = IDEGEN NEM TERMÉSZETES EREDETŰ (SZINTETIKUS) Pl: peszticidek, herbicidek, oldószerek, egyes szerves vegyületek Lebontásukra megoldás: - fizikai - kémiai - biológiai módszerek Az 1960-as évek elején felfedezték, hogy számos talajlakó mikroorganizmus képes a xenobiotikumok bontására. Egyféle szennyezés ritkán fordul elő, ált. vegyes hulladék sokféle enzim, mikroorganizmus szükséges.

Ahhoz, hogy megértsük a mikrobiális lebontási útvonalakat, szükséges a mikrobák alapműködésének ismerete. Metabolizmus: reakciók együttese, mely során a sejtek energiát és kémiai építőelemeket nyernek. Számos metabolikus út Szükséges elemek, vegyületek felvétele a környezetből (membrán transzport) glükózzal „könnyen” megy: glükóz PO43- NH4+ SO42- PO43- NH4+ SO42- glükóz prekurzorok építőelemek fehérjék sejtfal nukleinsavak glükogén

Biodegradáció Aromás, alifás, heterociklusos vegyületek lebontására számos folyamatot leírtak már különböző mikroorganizmusokban. A lebontó folyamat nyomonkövetése, igazolása e gyakorlat célja. Egy konkrét példán mutatjuk be egy aromás vegyület mikrobiális lebontását.

Szulfanilsav biológiai lebontása A szulfonált aromás vegyületek egyik képviselője a szulfanilsav, mellyel azofestékek, növényvédőszerek, és szulfonamid gyógyszerek (pl: vércukorszint-csökkentők, antibiotikumok,…) gyártása során találkozhatunk. Erős negatív töltése miatt a baktériumok sejtfalán valószínűleg nem jut át. Szulfanilsav

szulfanilsav p-amino-benzoesav folsav

Sphingomonas subarctica szulfanilsav: 248 nm szulfát: 420 nm 3 O H S 3 NADH+H+ NAD+ C O H S 3 O2 feltételezett aminotranszferáz szulfokatekol dioxigenáz szulfanilsav 4-szulfokatekol szulfomukonát szulfomukonát cikloizomeráz O C H S 3 Sphingomonas subarctica szulfanilsav: 248 nm szulfát: 420 nm szulfolakton szulfolakton hidroláz 3 H S O - O C H szulfát maleilacetát maleilacetát reduktáz TCA ciklus

Oxigenázok Aromás vegyületek aerob mikrobiális lebontásában mono- és dioxigenáz enzimek támadják az aromás gyűrűt. 1955 Osamuri Hayaishi - felfedezi az oxigenáz enzimeket dioxigenázok H. S. Mason - felfedezi a fenoláz enzimet monooxigenázok 1965- Irwin Gunsalus - citokróm P450 bakt. monoox. 1970 David Gibson - aromás szénhidrogén dioxigenázok - lebontó útvonalak tanulmányozása 1980- sok kutatócsoport - lebontási útvonalak feltérképezése Ananda Chakrabarty - katabolikus plazmid transzfer Pseudomonas törzsek között ----------------------------------- Monooxigenázok Dioxigenázok 1. Az aromás gyűrűre oxigént építő 2. Az aromás gyűrűt hasító

I. Monooxigenázok (hidroxilázok) Egy hidroxil csoportot kapcsolnak a molekulához, melyhez O2 molekulát használnak és elektron donorként NAD(P)H-t. az O2 molekula egyik atomját építik be a célmolekulába SH2 + O2 = SO + H2O (internal monooxigenáz, a szubsztrátról (S) jön az elektron) S + O2 + H2X = SO(H) + OH- + X (external monooxigenáz) Példák: p-hidroxibenzoát hidroxiláz család phenol 2-hidroxiláz alkil csoport hidroxiláz (metán monooxigenáz) kámfor 5 monooxigenáz (Citokróm P-450 család)

II. Dioxigenázok A reakcióhoz NAD(P)H-ra is szükség van. Az enzimreakció során a NAD(P)H-t az enzimen levő FAD oxidálja, a FADH2 kofaktorhoz kapcsolódik az O2, és egy reaktív hidroxiperoxiflavin tartalmú fehérje képződik. Ez egy reaktív köztiterméken keresztül hidroxilálja az aromás gyűrűt. A gyűrűt hasító enzimek O2 molekulát használnak a gyűrű hidroxilálásához, ezt követően egy második reakciót katalizálnak: a gyűrű felnyitását. a, orto/intradiol hasító dioxigenázok a két hidroxil csoport között nyitják a gyűrűt O H S 3 b, meta/extradiol hasító dioxigenázok a két hidroxil csoport mellett hasítanak