The lactose (lac) operon - an example for prokaryotic gene regulation A lac operon részei: 1. promoter, amely két részből áll: CAP hely, ami az activátor (CAP, catabolite activator protein) kötő helye, ill. az „entry” hely, ami az RNS polimeráz kötőhelye. 2. operátor, ahová a represszor kötődik, a struktúr gének, ill. a terminátor szekvencia. A struktúr gének: (a) lacZ gén, a béta-galaktozidáz nevű fehérjét kódolja, ami a lactózt bontja galaktózta és glükózra; (b) a lacY a permeázt kódolja, amely a laktóz sejtmembránon keresztül való átjutásában segít; lacA transzacetilázt kódolja, melynek biokémiai funkciója ismert (….), az élettani viszont nem. A lac represszor nem része az operonnak, de a lac operon szomszédágában helyezkedik el az E. coli DNS-én.

Nobel prize for the discovery of lac operon - 1965 1. Nobel prize for the discovery of lac operon - 1965 Francois Jacob Jacques Monod Pasteur Institute, Paris, France

The structure of lac operon 2. The structure of lac operon E. coli DNA operon promoter DNA P lacI promoter C E O lacZ Structural genes lacY lacA DNA T repressor CAP site RNA pol operator structural genes terminator binding site catabolit activator protein binding site A lac operon részei: 1. promoter, amely két részből áll: CAP hely, ami az activátor (CAP, catabolite activator protein) kötő helye, ill. az „entry” hely, ami az RNS polimeráz kötőhelye. 2. operátor, ahová a represszor kötődik, a struktúr gének, ill. a terminátor szekvencia. A struktúr gének: (a) lacZ gén, a béta-galaktozidáz nevű fehérjét kódolja, ami a lactózt bontja galaktózta és glükózra; (b) a lacY a permeázt kódolja, amely a laktóz sejtmembránon keresztül való átjutásában segít; lacA transzacetilázt kódolja, melynek biokémiai funkciója ismert (….), az élettani viszont nem. A lac represszor nem része az operonnak, de a lac operon szomszédágában helyezkedik el az E. coli DNS-én. Cytoplasm cell wall outer world

Structure lac operon 3.

Repression 4. rep pol rep: repressor pol: RNA polymerase DNA P lacI C lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator pol rep rep: repressor pol: RNA polymerase

Induction 5. rep lactose rep: repressor pol: RNA polymerase DNA P lacI lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator glucose galactose lactose rep: repressor pol: RNA polymerase

Induction 5. rep trans- acetylase permease b-gal pol rep: repressor DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator trans- acetylase permease b-gal pol rep: repressor pol: RNA polymerase

Activation 6. CAP CAP: catabolite activator protein cAMP No glucose DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator CAP CAP: catabolite activator protein cAMP No glucose

Activation 6. CAP pol cAMP No glucose DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA repressor CAP site entry site operator structural genes terminator CAP pol cAMP No glucose

Activation 6. CAP pol trans- acetylase permease b-gal DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator permease trans- acetylase b-gal

catabolite repression (endproduct inhibition) Activation 6. DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator CAP pol catabolite repression (endproduct inhibition) No cAMP Glucose is present

Structure and operation of lac operon 7. CAP Combined regulation pol DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator rep Glucose - Lactose + permease trans- acetylase b-gal lactose adenylate cyclase cyclic AMP adenylate cyclase glucose lactose allolactose (inductor!) cAMP ATP

Mutant beta-gal 8. Glucose - Lactose + CAP rep pol cAMP No glucose DNA lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator Glucose - Lactose + CAP rep pol cAMP No glucose

Mutáns béta-gal 8. CAP pol Glucose - Lactose + trans- b-gal* acetylase DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator Glucose - Lactose + permease trans- acetylase b-gal* lactose

Transcription stop in genes 9. Transcription stop in genes CAP pol stop DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator rep Glucose - Lactose + transcription stop permease b-gal

Transcription stop in genes 9. Transcription stop in genes CAP pol stop DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator rep Glucose - Lactose + b-gal

Transcription stop in genes 9. Transcription stop in genes CAP pol stop DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator rep Glucose - Lactose +

The Oc mutation of operon 10. The Oc mutation of operon The operator is not able to bind the repressor pol DNA P lacI C E Oc lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator Glucose - Lactose - CAP trans- acetylase permease b-gal pol rep

The I- mutation of repressor 11. The I- mutation of repressor The repressor is not able to bind to the operator pol DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator Glucose - Lactose - CAP trans- acetylase permease b-gal pol rep

The Is mutation of repressor 12. The Is mutation of repressor pol The repressor is unable to bind lactose DNA P lacI* C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator Glucose - Lactose + CAP pol rep

Mutant CAP-I 13. CAP is unable to bind cAMP Glucose - Lactose + CAP DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator Glucose - Lactose + CAP cAMP No glucose

Mutant CAP-I 13. CAP is unable to bind cAMP Glükóz - Laktóz + CAP pol DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator Glükóz - Laktóz + CAP pol cAMP No glucose

Mutant CAP-II 14. CAP can bind promoter in the absence of cAMP pol DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator Glucose + Lactose + CAP trans- acetylase permease b-gal pol rep

Too many repressors Repressor – on the plasmid 15. rep rep rep DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator rep Glucose - Lactose + CAP DNA P plasmid lacI rep pol rep DNA P plasmid lacI rep Transzlációs stop az F plazmidon lévő lacZ génben és a a baktérium DNS-en lévő lacY génben. Coli lacOc lacZ+ lacY-  -gal: folyamatosan termelődik F’ lacO+ lacZ- lacY+  permeáz: csak laktóz indukció hatására termelődik Következtetések: - lacI+ egy diffúzibilis represszor fehérjét kódol Laktóz hiányában a represszor a mindkét operátorhoz kapcsolódik és ezzel gátolja a transzkripciót. Laktóz jelenlétében a represszor gátlódik, s beindul a transzkripció Repressor – on the plasmid DNA P plasmid lacI rep DNA P plasmid lacI rep

Too many operators Operator – on the plasmid 16. pol Glucose - DNA P lacI C E O lacZ lacY lacA DNA T represssor CAP site entry site operator structural genes terminator Glucose - Lactose - CAP rep trans- acetylase b-gal permease pol DNA O plasmid rep Transzlációs stop az F plazmidon lévő lacZ génben és a a baktérium DNS-en lévő lacY génben. Coli lacOc lacZ+ lacY-  -gal: folyamatosan termelődik F’ lacO+ lacZ- lacY+  permeáz: csak laktóz indukció hatására termelődik Következtetések: - lacI+ egy diffúzibilis represszor fehérjét kódol Laktóz hiányában a represszor a mindkét operátorhoz kapcsolódik és ezzel gátolja a transzkripciót. Laktóz jelenlétében a represszor gátlódik, s beindul a transzkripció DNA O plasmid DNA O plasmid Operator – on the plasmid DNA O plasmid rep

Partial diploids: cis or trans-effect? CAP Glucose - Lactose - trans- acetylase b-gal pol perm* Transzlációs stop az F plazmidon lévő lacZ génben és a a baktérium DNS-en lévő lacY génben. Coli lacOc lacZ+ lacY-  -gal: folyamatosan termelődik F’ lacO+ lacZ- lacY+  permeáz: csak laktóz indukció hatására termelődik Következtetések: - lacO a lacZ and lacY génektől upstream helyezkedik el, és csak az ugyanzon a molekulán lévő gének működését befolyásolja. - lacO szabályozó szekvencia, nem diffúzibilis termék. Ha diffuzibilis lenne, akkor a permeáz is leíródna laktóz hiányában. rep pol Oc mutation – on bacterial DNA DNS P lacI C E Oc lacZ lacY- lacA DNS T

Partial diploids: cis or trans-effect? 17b. pol rep mutation DNA P lacI C E O lacZ- lacY lacA F plasmid T repressor CAP site entry site operator structural genes terminator permease trans- acetylase b-gal* CAP Glucose - Lactose + Glucose - Lactose - CAP trans- acetylase b-gal pol pol perm* rep 1. lacO occurs upstream of lacZ and lacY and affects production of proteins downstream on the same molecule. 2. lacO is a regulatory sequence; no diffusible product is produced. 3. If diffusible product is produced, expect permease production in absence of lactose. rep pol Oc mutation – on bacterial DNA DNA P lacI C E Oc lacZ lacY- lacA DNA T Coli lacOc lacZ+ lacY-  -gal: continuously expressed F’ lacO+ lacZ- lacY+  permease: only with lactose

Partial diploids: cis or trans-effect? 18. mutation rep DNA P lacI* C E O lacZ lacY- lacA DNA T trans- acetylase repressor CAP site entry site operator structural genes terminator b-gal rep perm* CAP rep Glucose - Lactose + Glucose - Lactose - CAP pol rep pol lacI+ produces a repressor protein (a diffusible product). 2. In absence of lactose, repressor protein binds to the operator and inhibits synthesis of downstream proteins. 3. In presence of lactose, repressor protein is inhibited by allolactose, and downstream protein synthesis occurs. permease trans- acetylase b-gal* rep I- mutation – on bacterial DNA rep DNA P lacI C E O lacZ- lacY lacA F plasmid T Coli lacI- lacO+ lacZ+ lacY- -gal  with lactose F’ lac I+ lacO+ lacZ- lacY+ permeáz  with lactose