Az endocitózis, hetero- és autofagocitózis és a vezikuláris transzport http://www.microscopyu.com/staticgallery/fluorescence/apm10.html Láng Orsolya Semmelweis Egyetem, Genetika, Sejt- és Immunbiológiai intézet FOK 2016 gsi.semmelweis.hu

MVB= multivezikuláris test Endocitózis Szekréció MVB= multivezikuláris test http://physrev.physiology.org/content/92/1/237

Endocitózis Anyagfelvétel Kompartmentek protein vagy lipid alkotórészeinek traszportja Metabolikus folyamatokat és sejtosztódást befolyásoló szignálok sejtbejuttatása Mikroorganizmusok elleni védelem

Endocitózis főbb formái Clatrin és caveolin független Pinocitózis Makro- pinocitózis Fagocitózis Clatrin mediálta Kaveola Clatrin és caveolin független Lizoszóma Korai endoszóma Fagocitózis – szilárd fázishoz közel álló anyag felvétele Pinocitózis – folyadék fázisú anyagok felvétele http://www.nature.com/nrm/journal/v8/n8/fig_tab/nrm2216_F1.html

Fagocitózis Speciális sejtek: egysejtűek makrofágok oszteoklasztok trofoblaszt sejtek Funkciók: tápanyagok felvétele immunválasz elöregedett sejtek eliminálása (pl. vvt.)

Fagocitózis Szükséges elemei: jel membrán receptor (pl.: antitest Fc receptora) álláb képződés kortikális aktin hálózat A kialakuló vezikulum: fagoszóma (hetero- vagy autofagoszóma)

Makropinocitózis folyamata 3. Plazma membrán fodrozódás-RUFLING 1. Aktiváció Ligand –receptor 4. Záródás kinyílik 2. Aktin hálózat átrendeződés 5. Makropinoszóma Emdoszómális-lizoszómális útvonal 0,2-5 um vezikulum Hatékony anyagfelvétel (folyadékfázisú) Szondázás mintavételek a környezetből, pl. antigén felismerés makrofágok esetében

Endocitózis - Pinocitózis Clatrin és caveolin független Clatrin mediálta Kaveola Clatrin és caveolin független Clathrin-burkolt vezikulum Nem-clathrin burkos vezikulum Caveolák Potocitózis Makropinocitózis

Clathrin burkos gödör/vezikulum Triszkelion 3 könnyű 3 nehézlánc Önszerveződés

Clathrin burkos vezikulum Receptor mediált endocitózis Molekulák szelektív felvétele (alacsony környezeti konc.) Membrán receptorok Ligand koncentrálása (1000x)

A burkos vezikulum felépítése

LDL receptor-mediált endocitózisa

Membrán proteinek szelektív burkos vezikulumba épülése = Adaptin2

Endoszómális-lizoszómális kompartment Szerkezet csöves, vezikuláris savas pH - vezikuláris H+ ATP-áz - proton pumpa korai (early)-endosoma (EE) és késői (late)-endosoma (LE), valamint lizoszóma (L) EE pH= 6; LE pH=5 az EE-ban NINCSENEK lizoszómális membrán proteinek vagy enzimek (szemben a LE-val)

Endoszómális-lizoszómális kompartment Funkció osztályozás transzport degradáció clathrin burok eltávolítása korai endoszóma (EE) képződése A korai endoszómában (EE): EEA1 (early endosome antigen) a jellegzetes fehérjekmponenese (fuzióban segít) a receptor-ligand komplex disszociációja - receptor-reciklizáció (pl. LDL, transferrin) receptor-ligand komplex közösen transzportálódik - receptor down reguláció (pl. EGF)

Multivezikuláris test (MVB)

Receptor- mediált endocitózis (inzulin, LDL vagy egyéb hormonok)

A receptor mediált endocitózis útján internalizálódott LDL sorsa

A transzferrin-ciklus Transzferrin receptor Fe2-transzferrin Apo-transzferrin Transzferrin receptor

Késői endoszóma Lizoszómák EE, TGN és autofagoszómákból képződik a lizoszómális enzimek M-6-P szignálja változik - a foszfát csoport lehasad – az M-6-P receptorok már nem kötik az enzimet a vezikulumok enzim tartalma a lumenbe kerül Lizoszómák

A receptor-ligand komplex disszociációja a késői endoszómában

MVB – exoszóma szekréció http://www.nature.com/nrm/journal/v8/n10/box/nrm2258_BX2.html

De Duve, Christian Nobel-díj - 1974 Lizoszómák (TEM)

Lizoszómális enzimek Enzimek-több mint 40 nem specifikus, savas hidrolázt pl. proteáz, nukleáz, glikozidáz, foszfatáz Membrán proteinek – glikoziláltak, mely megvédi őket az enzimek bontó hatásától Transzport molekulák a membránban – a proteolítikus bontás termékeit szállítják a citoplazmába

Lizoszóma szerkezete © 2000 by Geoffrey M. Cooper

A lizoszómában megemésztődő anyagok különböző eredetűek A megemészthetetlen anyagok a reziduális testben találhatók kiürülnek (exocitózis) vagy felhalmozódnak (öreg sejtek)

Residuális test, lipofuscin

Mukopoliszacharidózis Örökletes – AR, v. XR Lizoszómális enzim mutációja Gyakoriság összességében 1:2500 9 típus Tünetek változatosak: lép és a máj megnagyobbodás idegredszeri károsodás Betegség Hibás enzim Terápia –enzim pótlás MPS I típus α-L-iduronidáz kísérleti kipróbálás alatt MPS II típus iduronsav-2-szulfatáz gyógyászati forgalomban (idursulfase) MPS VI típus N-acetilgalaktózamin-4-szulfatáz gyógyászati forgalomban (galsulfase)

Nem-clathrin burkos vezikulumok a membránban nincsenek receptorok vagy clathrin az anyagok felvétele kevésbé szelektív elsődlegesen folyadék-fázisú endocitózis

Caveola 50-80 nm-es, palackszerű beboltosulásai a felszíni membránnak endothél, adipociták jellegzetes komponens - caveolin potocitózis – a caveola bezárul de nem internalizálódik, az anyagok innen a citoplazmába speciális hordozó molekulák útján kerülnek be pl. B4 vitamin egyes caveolák belépnek a sejtbe !!!

Caveolin oligomerek és a caveola összeépülése oligomerizáció

Caveola-k és a daganatok kezelése Tumor-associált caveola proteinek Antitestek melyek szelektíven ezeket a sejteket támadják

A dynamin szerepe Clathrin-mediált endocitózis Membrán „karbantartás” Endoszóma- -Golgi transzport Szekréciós vezikulum képzés a TGFben Caveola Folyadék-fázisú endocitózis

A dynamin szerkezete PH: Membránnal való kapcsolat GED: GTP-áz domain aktiválása PRD: Citoszkeletonhoz kapcsolódás

A dynamin GTP hidrolízisét igényli a vezikulumok leválasztásához nem-hidrolizálható GTP-gS hozzáadása a pontok az anti-dynamin antitest kötődés helyét jelzik a megnyúlt nyak jelzi, hogy bár a burkos vezikulum kialakult, GTP hidrolízis hiányában az leválni nem tud

Saját fehérjék lebontásának lehetséges útjai Proteaszoma Carrier mediálta proteolízis a lizoszómában Mikroautofágia Autofagocitózis Egyéb kompartmentekben pl. Golgi, szekréciós vezikulum

Proteaszoma Regulált proteolízis: A. Ciechanover, A. Hershko és I Rose Nobel-díj – kémia 2004 Regulált proteolízis: nem megfelelően hajtogatott vagy sérült fehérjék bontása (szintetizálódott fehérjék 20% ) szabályozó - elimináló – szerep: sejtciklus (ciklinek), DNS repair, transzkripció, stressz válasz, immunválasz elhelyezkedés: közel az ER-translocon külső részéhez https://www.youtube.com/watch?v=jbc1QCu9hFg

Proteaszoma szerkezete részei: Fedő : ATP-áz aktivitás, szubsztrát-kötő-, szabályozó-domain Beta –gyűrű: katalitikus domén β1 alegység - kaszpáz-szerű aktivitás, β2 alegység - tripszin-szerű aktivitás, β5 alegység - kimotripszin-szerű aktivitás.

Fehérje degradáció a proteaszómában Poliubiquitin lánc 2. Fehérje denaturáció 1. Ubiquitinálás 3. Degradáció

Ubiquitin lánc kialakítása E1 Ubiquitin aktiválás E3 Ubiquitin ligáz E2 Ubiquitin konjugáló

Fehérjék felvétele és degradációja lizoszómába – chaperon mediálta KFERQ- (lizin-fenilalanin-glutamát-arginin- glutamin) szignál Hősokkfehérje Hsc73 Protein csatorna Lamp2a Fehérje KFERQ HSC73 N C lizoszóma HSC73 N C proteázok Lamp2a N C

Fehérjék felvétele és degradációja lizoszómába - mikroautofágia citoplazma részletek a membrán betűrődésével jutnak be a lizoszómába Fehérje lizoszóma proteázok

Endocítózissal fordított topológia

Autofágia - Autofagoszóma 1963 De Duve hazsnálta először a fogalmat saját komponensek (fehérjék és sejtorganellumok) felvétele és bontása a lizoszómában Különböző formák Funkció: - sérült sejtkomponensek eltávolítása (pl. fehérjék) - a sejtorganellumok számát szabályozza - toxikus hatások szintén indukálhatják, pl éhezés - szövetspecifikus funkciók – vvt - sejten belüli patogének eltávolítása - programozott sejthalál egyik formája autolízis = patológiás, szabályozatlan folymat

Autofagocitózis folyamata – Makro autofagocitózis Indukció Izolációs membrán kialakulása Autofagoszóma kialakulása Fúzió a lizoszómával

Autofagocitózis genetikája Autofagoctózis vizsgálata élesztőben mutagenezis révén autofágiához szükséges gének identifikálhatók ATG géncsalád azonosítása 30 tag, humán homológok Yoshinori Oshumi Nobel-díj - 2016

Exocitózis (TEM)

Transzcitózis A ligandok az endoszómális compartmenteket megkerülik – nincs módosítás A ligandok a sejt egyik pólusáról a másik pólusára szállítódnak pl. az anyatej immunoglobulinjai a bél epithéliumán transzcitózissal jutnak át

Vezikuláris transport

James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof 2013 James E. Rothman, Randy W. Schekman and Thomas C. Südhof https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2013/med_image_press_eng.pdf

Intracelluláris vezikuláris transzport Kommunikáció – sejten belül; sejt-környezet Belső membránrendszer Anyagok felvétele és emésztés helyére (lizoszómák) szállítása - endocitózis Proteinek szállítása az ER-Golgi útvonalon a felszíni membránhoz - exocitózis

Vezikuláris transzport fő útvonalai a sejtben Endocitózis Szekréció MVB= multivezikuláris test http://physrev.physiology.org/content/92/1/237

Intracelluláris vezikuláris transzport A kétirányú, kompartmentek közti transzport egyensúlyban van Ezt a membránproteinek folyamatos visszaáramlása biztosítja Bioszintetikus-szekréciós útvonal Endocitotikus útvonal Helyreállító-fenntartó útvonalak

Transzport vezikulum A membránnal határolt vezikulumok meghatározott anyagokat szállítanak Szekréció Lizoszómális enzimek Membrán és ECM összetevői A szállítás irányát a membrán összetevői határozzák meg ld. donor és target compartmentek

A vezikuláris transzport molekuláris alapjai A bioszintetikus-szekréciós és az endocitotikus útvonalak 10 vagy több kompartment között teremtenek kapcsolatot Megfelelő molekuláris egyezés (receptor/ligand) határozza meg a transzport irányát, a membránok fúzióját.

Burkos vezikulumok A burok szerepe: Egyes membrán-komponenseket (pl. receptorok) meghatározott membrán-foltokba (patch) koncentrál A burokkal fedett felszín lefűződésének elősegítése – vezikulum képzés

Burkos vezikulumok típusai Clathrin-burkos vezikulum COPI-burkos vezikulum COPII-burkos vezikulum Mindegyik típusra eltérő traszport jellemző

A három burkos vezikulum morfológiailag is megkülönböztethető

Clathrin-burkos vezikulum: Golgi – plazmamembrán transzportok COPI- és COPII-burkos vezikulumok: dER - Golgi közti transzportok

Összefoglalás: Clathrin-burkos vezikulum

A clathrin-burok kialakulásában résztvevő protein-protein és protein-lipid kapcsolatok

Vezikuláris transzport: dER - Golgi

Anterográd Figure 13-24b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

dER-Golgi: Előre haladó transzport – COPII (1) Aktiválódás Szállítandó molekula bekötődése Sar1 – monomer G-fehérje

Előre haladó transzport – COPII (2) dER-Golgi: Előre haladó transzport – COPII (2) Burok összeszerelése –vezikulum kialakulása Figure 13-20 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

dER-Golgi: Előre haladó transzport – COPII (3) Vezikulum lefűződése Figure 13-13d Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Összefoglalás: COPII-burkos vezkulum

Retrográd Figure 13-24b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Golgi- dER: Retrográd transzport – COPI Figure 13-24a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Összefoglalás: COPI-burkos vezikulum

Vezikuláris transzort: A citoplazma egyéb részei

A ‘retromer’-t burkoló molekuláris komplex elemei - Retrográd transzport endoszómákból a TGN-be - SNX1 - Sorting nexin-1 PX – phosphoinositide binding domain BAR – dimerization and membrane binding VPS =vacuolar protein sorting VPS26 VPS29 VPS35

A vezikulum célba juttatás fő lépései SNARE – soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor Figure 13-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

A célbajuttató rendszer regenerálása NSF – N-ethylmaleimide sensitive factor Adaptor fehérjékkel köt a membránhoz és széttekeri a SNARE-ket Figure 13-18 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

A vezikulumok fúziójának lépései hemifúzió csőképződés fúzió Figure 13-17 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Molekuláris kölcsönhatások a fúzió során – Transz-SNARE komplex - Figure 13-16 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Homotipikus fúzió Figure 13-22 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Figure 13-15 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

SNARE proteinek szubcelluláris megoszlása syntaxin VAMP SNAP-25 egyéb CCP – cl.-coated pit CCV – cl-coated vesic. DCV – dense core vesic. IC – intermed. comp. SNARE – soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor

Figure 13-52 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Figure 13-54 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

A transzport egyéb fontos elemei

G-proteinek szerepe a vezikuláris transzportban (1) Többmint 20 tagú család Szabályozóelem GTP kötött az aktív forma, membránkötött GDP kötött forma szolubilis

Effektornak köszönhetően mind motor proteinhez, mind membránhoz kötődhet Adaptor fehérje, fúziós fehérje, enzim Inkativáció: GTP hidrolizise (Rab27-GAP) és Rab-GDP leválása

G-proteinek szerepe a vezikuláris transzportban (2)

Foszfoinozitidek szerepe Partner molekula kötése (pl. rab, effektor)

Foszfoinozitidek kompatrment specifikus lokalizációt mutattnak

Exocitózis

Az exocitózis fő lépései Figure 13-66a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

A szállított molekulák koncentrálása membrán leválás révén Figure 13-65a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Figure 13-72a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)