ANTIFOSZFOLIPID SZINDRÓMA LABORATÓRIUMI DIAGNOSZTIKÁJA BARABÁS ESZTER SE LMI- Központi Laboratórium, Pest Mediconsult továbbképzés- 2016.október.20.

ANTIFOSZFOLIPID SZINDRÓMA Olyan autoimmun betegség, amely vaszkuláris thrombosissal és/vagy terhességi morbiditással és tartósan pozitív antifoszfolipid ellenes antitestekkel társul, melyek direkt szerepet játszanak a klinikai tünetek kialakulásában. - Primer APS - Secunder APS Az antifoszfolipid szindróma (APS) a szerzett thrombophiliák fontos oka.

Történeti áttekintés 1983- Graham Hughes antikardiolipin ellenes antitestek és thrombosis, spontán vetélés, agyi történések, thrombocytopénia és livedo reticularis közötti összefüggések 1984- I. International Congress on Antiphospholipid Antibodies

APS kritériumrendszere 1998- Sapporo criteria 2006- Sidney criteria Klinikai kritériumok Laboratóriumi kritériumok

APS klinikai kritériumai Vaszkuláris thrombosis Egy vagy több artériás vagy vénás, ill. kis erekben kialakuló thrombosis, melyeket objektív, validált módszerekkel ( képalkotó technikával/Doppler v.hisztopatológiai vizsgálattal) igazoltak. A felszínes vénás thrombosis nem tartozik a klinikai kritériumok közé. A felülvizsgált kritériumokba nem tartoznak bele, de összefüggést mutathatnak APS-el az alábbi kórképek: livedo reticularis, szívbillentyű betegségek, thrombocytopénia, nephropathia, neurológiai eltérések.

APS klinikai kritériumai 2. Terhességi morbiditás a, Egy vagy több, normál morfológiájú fetus( UH-al v. a fetus direkt vizsgálata által dokumentálva) halála a terhesség 10.hete környékén. b, Egy vagy több normál morfológiájú újszülött koraszülése a 34.hét előtt, melyet súlyos preeclampsia vagy placenta elégtelenség okoz c, Három vagy több egymást követő, látszólag ok nélküli spontán abortusz a terhesség első tíz hetében, melyhez anyai anatómiai vagy hormonális eltérés és anyai vagy apai kromoszóma rendellenesség nem társul. A felülvizsgált kritériumokba nem tartoznak bele, de összefüggést mutathatnak APS-el az alábbi nőgyógyászati kórképek: placenta leválás, két látszólag ok nélküli spontán abortusz, két vagy több megmagyarázhatatlan IVF sikertelenség

APS laboratóriumi kritériumai Minden laboratóriumi kritérium, legalább 12 hetes időközben, 2 vagy több alkalommal igazolva legyen. Lupus antikoaguláns (LA) kimutatása az ISTH iránymutatása szerint. Antikardiolipin antitest IgG és/vagy IgM izotípusa, közepes vagy magas titerben (> 40 GPL/MPL vagy >99 percentilis), standardizált ELISA-val detektálva. Anti-ß2-glikoprotein I ellenes antitest IgG és/vagy IgM izotípusú, közepes vagy magas titerben (> 99 percentilis), standardizált ELISA-val detektálva.

APS betegek csoportosítása a laboratóriumi tesztek pozitivitása alapján Egynél több laboratóriumi kritérium fennállása. IIa. Csak LA van jelen IIb. Csak antikardiolipin antitest detektálható IIc. Csak anti-ß2-glikoprotein I ellenes antitest van jelen

APS diagnosztikai kritériuma APS határozottan jelen van, ha legalább egy klinikai kritérium és egy laboratóriumi kritérium teljesül. Ha a pozitív laboratóriumi teszt és a klinikai tünetek között kevesebb, mint 12 hét vagy több, mint 5 év telik el, az APS-ba való besorolás kerülendő.

Pathogenézis

Klinikai kép - Aszimptomatikus aPL hordozó betegek - Klasszikus APS tüneteket hordozó betegek - aPL pozitív betegek, ezek nem thrombotikus megnyilvánulásaival, mint pl.thrombocytopénia, livedo reticularis, neurológiai eltérések (migrén, demencia) - Katasztrofális APS (CAPS) az APS-s betegek kevesebb, mint 1%-ában, kiterjedt, mikrovaszkuláris thrombosissal 3 vagy több szervben, mely sokszervi elégtelenséghez vezet. Mortalitása akár 50%.

Klinikai kép Az aPL jelenléte általában igen erősen asszociált a különböző thrombotikus klinikai történésekkel. Hypoprothrombinaemia, súlyos thrombocytopénia, thrombocyta funkció zavar és urémia lupus antikoagulánssal egyidőben történő jelenléte esetén azonban vérzékenység is lehet a klinikai tünet, amely elsősorban a bőr, nyálkahártya és lágyrészek vérzésében nyilvánul meg.

Antifoszfolipid ellenes antitest meghatározás-kikben? Fiatal betegekben (<50 év) Idiopathiás thrombosis Szokatlan helyen lévő thrombosis Megmagyarázhatatlan, visszatérő thrombosis Ha társult autoimmunbetegség van jelen Cryptogen stroke, illetve hozzá kapcsolódó dementia, livedo reticularis, epilepszia, szívbillentyű rendellenesség, atherosclerosis hiányában vetélés (különös tekintettel a magzati elhalásra) „váratlanul” észlelt APTI megnyúlás tünetmentes egyénnél

Antifoszfolipid ellenes antitest meghatározás-MIKOR? Vénás thrombosisban szenvedő betegeknél antikoaguláns kezelés megkezdése előtt, folytatása vagy tervezett abbahagyásakor Artériás thrombosisban szenvedő betegeknél, kezdetben, thrombocyta gátló és/vagy antikoaguláns terápia szükségességének az eldöntésére Vetélő nőkben, a kezdetben, terhesség alatti megfelelő terápia kiválasztására

Antifoszfolipid ellenes antitest meghatározás-MIT?

Antikardiolipin ellenes antitest meghatározás antikardiolipin antitest IgG, IgM Közepes vagy magas titerben (>40 GPL vagy MPL, vagy >99 percentilis)

IgG aCL szintek és a klinikai kép

ß2-glikoprotein Apolipoprotein H néven is ismert. 50 kD-os fehérje, 326 aminosav, 5 domén A keringésben cirkuláris (I. és V. domén összekapcsolódik) alakban van jelen, ha a pozitív töltésű V. domén negatív töltésű foszfolipid felszínhez kötődik, akkor a cirkuláris alak kinyílik és horog alakot vesz fel Az első négy domén szabályos, konzervált szekvenciával rendelkezik, de az V. abberáns

ß2-glikoprotein V.domén Csak eukariótákban lelhető fel Egy rugalmas és egy hidrofób hurokkal rendelkezik Anionos foszfolipidekhez nagy affinitása van

ß2-glikoprotein konformáció változása de Laat B ,de Groot PG. Curr Rheumatol Rep (2011)

Anti-ß2-glikoprotein I ellenes antitest de Groot PG , Urbanus RT. BLOOD 2012

ß2-glikoprotein I ellenes antitest - ß2-glikoprotein ellenes antitestek közül az I-es domén ellenes antitestek lupus antikoaguláns pozitivitást is okozhatnak( in vitro LA aktivitást expresszálnak) és gyakran antikardiolipin pozitivitás is társul hozzájuk (tripla pozitivitás). Szoros összefüggést mutatnak thromboembóliás eseményekkel és terhességi morbiditással[Pengo V, Blood 2011] - IV/V-ös domén ellenes antitestek esetén csak ß2-glikoprotein ellenes antitest pozitivitást tapasztalunk és nem társulnak thromboembóliás történésekkel, hanem atherosclerosisban, atópiás dermatitisben szenvedő gyerekeknél és szizstémás autoimmun betegségben szenvedő anyák újszülötteinél mutathatóak ki. - Az anti Dm1/anti Dm4/5 ráta hasznos lehet az APS diagnózisában[Andreoli, Arth.Rheum. 2015]

ß2-glikoprotein I ellenes antitest Antibodies that bind specifically to limited epitope on domain 1 of the protein (Gly40-Arg43) are most strongly associated with thrombosis. (de Laat et al, 2005)

Guidance recommendations from the SSC of the ISTH 2014 Human b2GPI should be used as b2GPI source. Between-run imprecision:< 20% (ELISA) ,< 10% (automated systems). Internal quality control material should be included . At least one non-kit negative or positive controls. Duplicate testing for calibrators, controls and patient samples. A multi-point calibration curve in every run for ELISA. External quality control scheme is strongly recommended.

Lupus antikoaguláns Lupus anticoagulants are somewhat akin to subatomic particles and extrasolar planets, in that they are „detected” by inference, after exclusion of other possible causes of test findings. (G.W.Moore,Semin.Thromb.Hemost.2014)

Lupus antikoaguláns A lupus antikoaguláns nem egy meghatározott foszfolipidhez kötött fehérje ellen irányul, hanem egy funkcionális entitás, melyet az alábbiak jellemeznek: IgG, IgM v.mindkét típusú olyan immunglobulin, mely interferál foszfolipid függő alvadási tesztekkel Valamilyen foszfolipid-fehérje komplex ellen irányul, és nem alvadási faktorok ellen, a reaktív epitóp pedig a fehérjén van In vitro antikoaguláns, in vivo fokozott veszélyeztetettséget jelenthet vénás és feltehetően artériás thrombosisra is Korrekt diagnosztikai eljárásokkal jól elkülöníthető egyéb keringő antikoagulánsoktól.

Lupus antikoaguláns diagnosztika nehézségei - Nincs specifikus teszt a számos antitest azonosítására, indirekt bizonyítékokkal igyekszünk igazolni a LA jelenlétét. - A különböző tesztek érzékenysége eltérő, nincs olyan teszt, ami teljes biztonsággal minden antitesttípust detektál, ezért két, különböző elvű teszt elvégzése javasolt a szűréshez (pl.dRVVI és LA érzékeny APTI) - LA detektálása igen problematikus vagy nem lehetséges antikoaguláns terápián lévő betegben. - Preanalitika fontossága , különösen alacsony titerű LA kimutatása esetén. - Akut thrombosis időszakában LA diagnosztika kerülendő! - Specifikus alvadási faktorok ellen irányuló inhibitor jelenléte befolyásolja az eredményeket és azok interpretációját.

Guidelines for lupus anticoagulant detection

Preanalitika A plazmában lévő reziduális thrombocyta tartalom alvadási idők rövidüléséhez és alacsony titerű LA elfedéséhez vezethet, különösen fagyasztást-felolvasztást követően Citráttal (0,109 mol/L) alvadásgátolt vér 2x-i centrifugálása által jutunk thrombocytaszegény plazmához (<10x 109 /L) Szűrőtesztek elvégzése (PR,aPTI,TI)

Következtetés általi kimutatás - Szűrés: foszfolipid függő alvadási teszteknél megnyúlt alvadási idő - Keverés: az alvadási megnyúlást okozó inhibitor kimutatása keveréses vizsgálattal - Megerősítés: az inhibitor foszfolipid függésének kimutatása, hozzáadott foszfolipiddel

Milyen szűrőtesztet használjunk?

Keveréses vizsgálat Keverék = beteg plazma és poolozott normál plazma 1:1 arányú keveréke Inkorrigábilis aPTI megnyúlás: aPTIkeverék - aPTIkontroll > 5 sec A klasszikus LA azonnal ható inhibitor. Néhány plazmában azonban az LA aktivitás időfüggést mutat (gyenge ill. progresszív inhibitor).

Keveréses vizsgálat

Megerősítő tesztek

Megerősítő tesztek A gátlás foszfolipid függésének bizonyítására (hozzáadott foszfolipid hatására kóros alvadási idők rövidülnek) A kóros szűrőteszten kell alapulnia dRVVT megerősítő tesztje: dRVVT ráta› 1,2 neutralizáció hexagonális foszfolipidekkel: alv.idő FL nélkül – alv.idő hex.FL-del > 8 sec

LA diagnosztika algoritmusa-LMI dRVVT (PL-) LA érzékeny APTI < cut off megnyúlt APTI nem prolongált APTI LA nem kimutatható >cut off APTI keverék dRVVT ráta dRVVT (PL+) nem korrigál korrigál >1,2 <1,2 APTI keverék 37⁰C 1h Hexagonális PL teszt LA jelen van korrigál >8 sec pozitív <8 sec negatív LA kizárva Faktor meghatározás Egyéb gátlótest

Fals pozitív LA - idős betegek vizsgálatakor - enyhén pozitív eredmények esetén (izolált LA pozitivitás klinikai esemény hiányában) - antikoaguláns terápia mellett végzett vizsgálatkor első vizsgálat alkalmával

APS betegek csoportosítása a laboratóriumi tesztek pozitivitása alapján I: mindhárom laboratóriumi kritérium fennállása (tripla pozitivitás: LA, ACA és aß2GP) II: dupla pozitivitás (ACA és aß2GPI) III: szimpla pozitivitás

Antifoszfolipid antitest profil és thrombosis kapcsolata ACA aß2GPI THROMBOSIS + Nagy thrombosis rizikó - Közepes thrombosis rizikó Nincs összefüggés thrombosissal

TAKE-HOME MESSAGE A felsorolt irányelvek hasznos, iránymutató eszközök az aPL antitestek meghatározásában és az APS diagnózisának a felállításában. Az eredményeket a teljes laboratóriumi kép ismeretében kell interpretálni.

Köszönöm a figyelmet !