Poszt transzlációs módosulások

glikofoszfatidilinozitol

https://www.youtube.com/watch?v=gm-I1OVhB54

Példák Proteolitikus hasítás Foszforiláció Karboxiláció Acetiláció Poli-ADP kapcsolás Ubiquitin-kapcsolás SUMO-kapcsolás S/T - Y- P P COO- N-Ac PAR Ubq Ubq Ubq Ubq SUMO

Kiváltott hatás alapján Irreverzibilis- hasítás Reverzibilis* módosulás (addició) Enzim aktiválás kimotripszinogén Enzim inaktiválás PARP Komplexképzés fibrin Lebontási szignál új N-terminális kialakítása- kohezin Enzim aktiválás PKA, glikogénbontás Enzim inktiválás glikogén szintáz Komplexképzés hiszton-acetiláció szignálszekvenciák beépítése/eltávolíása Ubiquitin, SUMO Jelátvitel inzulin receptor Receptor érzéketlenítés GPCR foszforiláció S/T - P S/T - P N-Ac Ubq Y- P S/T - P * Enzimkatalizált egyszerre egy irányba megy, de létezik az ellentétes folyamat

Enzim aktivációs kaszkád Jelerősítés Többlépcsős kaszkádszerű szabályozás- többirányú szabályozás (több szint szabályozása egyszerre – biztosra megyünk) Gyors beindítás/leállítás – emésztés, véralvadás Jelpályák közötti kapcsolatok

Zimogének limtált proteolízise Az enzim inaktív ún proformája szintetizálódik, mely enzimatikus kötés hasítás- limitált proteolízis után éri el az aktív formát Teljesen irreverzibilis, egyszeri alkalom Extracelluláris proteinek is aktiválhatók Emésztőenzimek – adott helyen Véralvadás – adott körülmények között Proinzulin, prokollagén Programozott sejthalál prokaszpáz Speciális szabályozási igény 8

Emésztési Kaszkád fő aktivációs lépés 9

Emésztési Kaszkád Hatásos inhibítor fő aktivációs lépés 10

Kimotripszinogén aktiválása vékonybél Arg Ile Diszulfid hidak 11

Kimotripszinogén-α-kimotripszin Mindössze ezen peptid kötések hasítására Ile16-Asp194 távolság drasztikus változása (21,6 Å -4,7Å) http://mcdb-webarchive.mcdb.ucsb.edu/sears/biochemistry/tw-enz/chymotrypsinogen-chymotrypsin-f.htm

Véralvadási kaszkád Kevés iniciáló molekula – mégis gyors reakció Intrinzik: anionos felület Extrinzik: felszabaduló vegyületek Sárga= aktív proteáz Fibrin (Ia) Piros= inaktív proteáz 13

Véralvadási kaszkád A trombin visszaható módon leállítja a kaszkádot (negative feedback) Sárga= aktív proteáz Fibrin (Ia) Piros= inaktív proteáz 14

Fibrinogén  fibrin Oldható  oldhatatlan? Hogyan? A szöveti-transzglutamináznak szerepe van a programozott sejthalál folyamatokban (apoptosis) is 15

1. Fibrinopeptidek hasítása Izopeptid keresztkötés Fibrinogén  fibrin Oldható  oldhatatlan? Hogyan? Polimerizáció  polmerizációt gátló peptidek levágása Enzimatikus hasítás  új kölcsönhatás jöhet létre (vö. kimotripszin) 1. Fibrinopeptidek hasítása 2.Térhálós komplex képződik trombin 1 protranszglutamináz trombin A szöveti-transzglutamináznak szerepe van a programozott sejthalál folyamatokban (apoptosis) is transzglutamináz 3 Izopeptid keresztkötés 3. Kovalens kapcsolás 16

Protrombin Foszfolipid réteg vérlemezkékből – negatív töltés Ca2+ szignál odavonzza a protrombint Fibrin (Ia) 17

Protrombin szintézis Protrombin szintézist K-vitamin függő enzim végzi K-vitamin antagonista jelenlétében szintetizált protrombin szekvenciája a normál szekvenciával egyezik mégsem köt Ca2+-t véralvadási zavarok paradoxon 18

Szekvencia egyezési paradoxon feloldása COO- Szekvencia egyezési paradoxon feloldása Szekvencia azonos, egyik fehérje mégsem köt Ca2+-t paradoxon A különbség a két fehérje között nem a primer szekvenciában keresendő PTM: - karboxiláció azaz -karboxiglutaminsav jelenléte/hiánya Melyik lehet az aktív forma? 2

Szekvencia egyezési paradoxon felolása COO- Szekvencia egyezési paradoxon felolása Szekvencia azonos, egyik fehérje mégsem köt Ca2+-t paradoxon A különbség a két fehérje között nem a primer szekvenciában keresendő PTM: - karboxiláció azaz -karboxiglutaminsav jelenléte/hiánya Melyik lehet az aktív forma? -karboxiglutaminsav jobb Ca2+-t kötő képesség A K-vitamin tehát gamma-glutamil-karboxiláz kofaktor Mik a K-vitamin antagonisták felhasználási lehetőségei? 2

Szekvencia egyezési paradoxon felolása COO- Szekvencia egyezési paradoxon felolása Szekvencia azonos, egyik fehérje mégsem köt Ca2+-t paradoxon A különbség a két fehérje között nem a primer szekvenciában keresendő PTM: - karboxiláció azaz -karboxiglutaminsav jelenléte/hiánya Melyik lehet az aktív forma? -karboxiglutaminsav jobb Ca2+-t kötő képesség A K-vitamin tehát gamma-glutamil-karboxiláz kofaktor Mik a K-vitamin antagonisták felhasználási lehetőségei? Véralvadásgátló (antikoaguláns) gyógyszerek, mérgek 2

Foszforilációs kaszkádok Léteznek reverzibilis kaszkádok is

Foszforláció/defoszforiláció S/T - Y- Foszforláció/defoszforiláció P P Foszforiláció: protein kinázok Defoszforiláció: Foszfoprotein foszfatázok Egyik „leggyakrabban” alkalmazott szabályozási mód Ez alapján milyen tulajdonságokat feltételezhetünk? 23

Foszforláció/defoszforiláció S/T - Y- Foszforláció/defoszforiláció P P Egyik „leggyakrabban” alkalmazott szabályozási mód „reverzibilis”- de egyszerre csak egy irányba játszódik le Spontán rendkívül lassan játszódik le Kinázok egyik legnagyobb fehérjecsaládot alkotják – az eukariota génállomány 2-3%-a proteinkinázokat kódol 550-féle ismert humán protein-kináz Miért van szükség ennyi féle protein-kinázra? 24

Foszforláció/defoszforiláció S/T - Y- Foszforláció/defoszforiláció P P Miért van szükség ennyi féle protein-kinázra? Finomhangolás Szöveti specificitás szubsztrát specificitás Multifunkciós dedikált kinázok speciális felismerési szekvencia Megfelelő konformáció Sebesség Kis nagy hatékonyság 25

Protein kináz − foszfát csoport transzfer fehérjére S/T - Y- P P Protein kináz − foszfát csoport transzfer fehérjére Honnan? 26

Protein kináz − foszfát csoport transzfer fehérjére S/T - Y- P P Protein kináz − foszfát csoport transzfer fehérjére Honnan? ATP-ről Közös tulajdonság ATP kötő zseb Hová? Jegyzet!!!! Kovács M. 27

Protein kináz − foszfát csoport transzfer fehérjére S/T - Y- P P Protein kináz − foszfát csoport transzfer fehérjére Honnan? ATP-ről Ettől egyirányú Közös tulajdonság ATP kötő zseb Hová? -OH csoportra Ser, Tre Tyr Miért külön család a Ser/Tre vs Tyr kinázok? 28

Miért alkalmas a foszfát csoport jelzésre? S/T - Y- P P Miért alkalmas a foszfát csoport jelzésre? Kép nomenklatura 29

Miért alkalmas a foszfát csoport jelzésre? S/T - Y- P P Miért alkalmas a foszfát csoport jelzésre? két negatív töltés elektrosztatikus kölcsönhatások változása Hidrogénkötések, szigorúan meghatározott tetragonális geometria Jelentős energiafelszabadulás, elősegíthet konformáció változásokat ATP sejt energia állapota és a szabályozás itt kapcsolódik Kép nomenklatura 30

S/T - Y- P P 31

Kinázok aktiválódása Más kinázok által - PTM S/T - Y- Kinázok aktiválódása P P Más kinázok által - PTM Különböző ligandumok által indukált -allosztérikus cAMP Ca2+ -kalmodulin (CaM kinázok) kép

Példák kinázok aktiválására Allosztérikus kináz aktiválás Receptor kinázok (ligandkötés hatására autofoszforiláció) Inzulin receptor cAMP aktiválja a protein kináz A-t (jelátvitel) Más kinázok általi aktiválás: PKA aktivál foszforiláz-kináz és foszforiláz (glikogén lebotás)

Jelátviteli kaszkád Elsődleges hírvivő- mindig extracelluláris Jelközvetítés- szükséges egy közvetítő G-protein kapcsolt receptor (GPCR) vagy más néven 7-transz-membrán hélix fehérje 7TM Konformációváltozás az elsődleges hírvivő hatására Konformációváltozás, dimerizáció Másodlagos hírvivő aktiválódása mindig intracelluláris hatására leggyakrabban foszforiláció megy végbe Receptor-ligand komplex közvetlenül fehérjefoszforilációval aktiválja a jelpályát Jelerősítés enzimatikus úton

Inzulin receptor egy receptor tirozin kináz Inzulin kötődés a dimer receptorhoz keresztfoszforilálás

Inzulin által kiváltott hatás a glikogén szintézisre S/T - Y- Inzulin által kiváltott hatás a glikogén szintézisre P P Felépítés aktiválása glikogén szintáz enzim defoszforilálással Lebontás inaktiválása Foszforiláz kináz enzim defoszforilálással

Glikogén lebontás és szintézis -reciprok szabályozás S/T - Glikogén lebontás és szintézis -reciprok szabályozás P Protein kináz A 1) Lebontás aktiválása 3) Felépítés inaktiválása Piros zöld Protein kináz A Az útvonalat aktiváló protein foszfatáz (PP1) enzim dezaktiválása 2 ) Lebontás aktiválás kioltása

Foszforiláció szerepe a glikogén lebontás szabályozási útvonalában S/T - P Foszforiláció szerepe a glikogén lebontás szabályozási útvonalában Általános jeláviteli lépések Glikogén bontásra jellemző lépések Foszforiláz-kináz és foszforiláz

cAMP másodlagos hírvivő felszabadulása PKA a sejt differenciáltságának megfelelő fehérjéket képes foszforilálni proteinkináz A-t aktiválja cAMP Aktivált adenilát-cikláz Aktivált G protein Aktivált GPCR hormon Glikogénbontás Fight or flight CREB transzkripciós aktivátor

PKA allosztérikus aktiválása Fontos a ki-be kapcsolhatóság R- regulatory/szabályozó domain C- catalitic/katalitikus domain Protein kináz A xxxxxxxxxxxxxxxxxxx Stryer Biochemistry 5th edition Figure 10.28

Foszforiláció szerepe Enzim aktiválás Enzim inaktiválás Fehérje-fehérje komplexek képződésének gátlása elősegítése

Magi lokalizációs szignál Róna G. C-citoplazma N- sejtmag A magi lokalizációs szignál (NLS nuclear localisation signal) reverzibilis módosításával a fehérje lokalizációja változtatható

Magi lokalizációs szignál foszforilálása S/T - Magi lokalizációs szignál foszforilálása P Az NLS-ben lévő szerin foszforilálásának hatása a lokalizációra Hogyan lehetne ezt megvizsgálni? - - szerin szerin foszfo-szerin

Magi lokalizációs szignál foszforilálása S/T - Magi lokalizációs szignál foszforilálása P Az NLS-ben lévő szerin foszforilálásának hatása a lokalizációra Hogyan lehetne ezt megvizsgálni? - - szerin Mutáns fehérjékkel Hiperfoszforilált analóg Méret ellenőrzés Hipofoszforilált analóg -

NLS foszforiláció- esettanulmány Róna G. S/T - P Ser S   NLS Lokalizáció. P-2 P-1 P0 P1 P2 P3 P4 P5 P6 DUT wt I S P K R A N DUT S11E E C változik DUT S11Q Q nem változik — Glu E Negatív töltés és méretkülönbség Gln Q méretkülönbség Jelzés!!!! Negatív töltés okozza a kizáródást a magból Export inhibícióját követően a lokalizációs mintázat nem változik, tehát az importban következik be változás – importin nem kapcsolódik a foszforilált fehérjhez C C

Hiszton fehérjék poszttranszlációs módosulásai Metiláció Acetiláció Arginin dezaminálódás polyADP-kapcsolás

Hiszton acetiláció Kromatinszerkezet változtatása Vajon ez gátolja vagy segíti a génkifejeződést?

Hiszton acetiláciáció Transzkripció elősegítése DNS-hiszton kölcsönhatás gyengül (pozitív töltés megszűnik) A kromatin átrendeződést elősegíti- kromatin remodelling fehérjék ún. bromodomén-je felismeri TAF*-ok bromodomén-je felismeri az acetilált lizint (*TATA-box-binding protein associated factors), segíti a transzkripciós komplex lokalizációját chromatin-remodeling engines. These complexes, which also contain domains homologous to those of helicases (Section 27.2.5), utilize the free energy of ATP hydrolysis to shift the positions of nucleosomes along the DNA and to induce other conformational changes in chromatin (Figure 31.30)

Ubiquitin-a halál csókja Ubq Ubiquitin-a halál csókja 76 aminosavból álló polipeptid

Ubq Ubiquitin-kapcsolás Kapcsolás az ubiquitin C-terminális karboxilcsoportja a protein vagy másik ubiquitin lizinjének  -aminocsoportján izopeptid kötéssel (nem a főláncban lévő peptid kötés)

Ubq Ubikvitin-kapcsolás Legalább 4 Ubq egység szükséges a hatékony lebontáshoz Kisebb a jelvesztés valószínűsége, Kiterjedt kötődési felszín Legalább 4 Ubq egység szükséges a hatékony lebontáshoz Kisebb a jelvesztés valószínűsége, Kiterjedt kötődési felszín Figure 6–93 The marking of proteins by ubiquitin. Each modification pattern shown can have a specific meaning to the cell. The two types of polyubiquitylation differ in the way the ubiquitin molecules are linked together. Linkage through Lys48 signifies degradation by the proteasome whereas that through Lys63 has other meanings. Ubiquitin markings are “read” by proteins that specifically recognize each type of modification.

poliubikvitinálás Többféle kapcsolódás - Többfél jelentés Ubq Ubq Ubq DNS javítás Transzlézió aktiváció Fehérje lebontás

Ubq Ubiquitin-kapcsolás Fehérje lebontás Transzlézió aktiváció

Ubiquitin-kapcsolás folyamata Ubq E3 ubiquitin ligáz ismeri fel a degradációs szignált, több mint 1000 különböző E3 fehérje van kódolva az emlős genomokban

Degradációs szignál aktiválása Ubq Degradációs szignál aktiválása N-terminális szabály

N-terminális szabály Fehérje transzláció Ubq N-terminális szabály Fehérje transzláció iránya NC Iniciáció AUG  metionin N-terminális aminosav metionin (formil- metionin baktériumokban) Metionin amidopeptidáz Speciális restrikciós enzimek- kohezin hasítása degradációs szignál alakul ki (különben kromoszóma vesztés) Many Proteins Are Controlled by Regulated Destruction One function of intracellular proteolytic mechanisms is to recognize and eliminate misfolded or otherwise abnormal proteins, as just described. Yet another function of these proteolytic pathways is to confer short lifetimes on specific normal proteins whose concentrations must change promptly with alterations in the state of a cell. Some of these short-lived proteins are degraded rapidly at all times, while many others are conditionally short-lived, that is, they are metabolically stable under some conditions but become unstable upon a change in the cell’s state. For example, mitotic cyclins are long-lived throughout the cell cycle until their sudden degradation at the end of mitosis, as explained in Chapter 17. How is such a regulated destruction of a protein controlled? Several mechanisms are illustrated through specific examples that appear later in this book. In one general class of mechanism (Figure 6–94A), the activity of a ubiquitin ligase is turned on either by E3 phosphorylation or by an allosteric transition in an E3 protein caused by its binding to a specific small or large molecule. For example, the anaphase-promoting complex (APC) is a multisubunit ubiquitin ligase that is activated by a cell-cycle-timed subunit addition at mitosis. The activated APC then causes the degradation of mitotic cyclins and several other regulators of the metaphase–anaphase transition (see Figure 17–44). Alternatively, in response either to intracellular signals or to signals from the environment, a degradation signal can be created in a protein, causing its rapid ubiquitylation and destruction by the proteasome. One common way to create such a signal is to phosphorylate a specific site on a protein that unmasks a normally hidden degradation signal. Another way to unmask such a signal is by the regulated dissociation of a protein subunit. Finally, powerful degradation signals can be created by cleaving a single peptide bond, provided that this cleavage creates a new N-terminus that is recognized by a specific E3 as a “destabilizing” N-terminal residue (Figure 6–94B). The N-terminal type of degradation signal arises because of the “N-end rule,” which relates the lifetime of a protein in vivo to the identity of its N-terminal residue. There are 12 destabilizing residues in the N-end rule of the yeast S. cerevisiae (Arg, Lys, His, Phe, Leu, Tyr, Trp, Ile, Asp, Glu, Asn, and Gln), out of the 20 standard amino acids. The destabilizing N-terminal residues are recognized by a special ubiquitin ligase that is conserved from yeast to humans. As we have seen, all proteins are initially synthesized bearing methionine (or formylmethionine in bacteria), as their N-terminal residue, which is a stabilizing residue in the N-end rule. Special proteases, called methionine aminopeptidases, will often remove the first methionine of a nascent protein, but they will do so only if the second residue is also stabilizing according to Nend rule. Therefore, it was initially unclear how N-end rule substrates form in vivo. However, it is now understood that these substrates are formed by sitespecific proteases. For example, a subunit of cohesin, a protein complex that holds sister chromatids together, is cleaved by a highly specific protease during the metaphase–anaphase transition. This cell-cycle-regulated cleavage allows separation of the sister chromatids and leads to the completion of mitosis (see FROM RNA TO PROTEIN 395 proteasomal DNA repair degradation histone regulation endocytosis MONOUBIQUITYLATION MULTIUBIQUITYLATION POLYUBIQUITYLATION Figure 6–93The marking of proteins by ubiquitin. Each modification pattern shown can have a specific meaning to the cell. The two types of polyubiquitylation differ in the way the ubiquitin molecules are linked together. Linkage through Lys48 signifies degradation by the proteasome whereas that through Lys63 has other meanings. Ubiquitin markings are “read” by proteins that specifically recognize each type of modification.Figure 17–44). The C-terminal fragment of the cleaved subunit bears an N-terminal arginine, a destabilizing residue in the N-end rule. Mutant cells lacking the N-end rule pathway exhibit a greatly increased frequency of chromosome loss, presumably because a failure to degrade this fragment of the cohesin subunit interferes with the formation of new chromatid-associated cohesin complexes in the next cell cycle.

N-terminális szabály A fehérje féléletideje S. cerevisiae élesztőben Ubq N-terminális szabály A fehérje féléletideje S. cerevisiae élesztőben Met, Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Pro - > 20 hrs (stabilizáló) Ile, Glu - kb. 30 min (stabilizáló) Tyr, Gln - kb. 10 min (destabilizáló) Leu, Phe, Asp, Lys - kb. 3 min (destabilizáló) Arg - kb. 2 min (destabilizáló)

SUMO-kapcsolás (sumoylation) SUMO Small Ubiquitin-like Modifier Sejtmagi (Nucleocitoplazmás) transzport Transzkripció-reguláció http://link.springer.com/content/pdf/10.1007%2F978-90-481-2649-1_6

DNS javító mechanizmusok működésbe lépnek PARP PAR Poli-ADP-ribóz (PAR) polimeráz Felismeri az egyszálú DNS törést – molekuláris nick szenzor (Cink-ujj motívumok) Poli-ADP-ribóz (PAR) szignál hiszton fehérjékre (epigenetika) jobb hozzáférés Önmagára is PAR-t kapcsol – XRCC1 javítóenzim vonzása Methods Enzymol. 2006;409:493-510. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation during DNA damage and repair. Dantzer F, Amé JC, Schreiber V, Nakamura J, Ménissier-de Murcia J, de Murcia G. Source Département Intégrité du Génome, CNRS Laboratoire Conventionne avec le Commissariat à l'Energie Atomique, Ecole Supérieure de Biotechnologie de Strasbourg, Illkirch-Cedex, France. Abstract Changes in chromatin structure emanating from DNA breaks are among the most initiating events in the damage response of the cell. In higher eukaryotes, poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) translates the occurrence of DNA breaks detected by its zinc-finger domain into a signal, poly ADP-ribose, synthesized and amplified by its DNA-damage dependent catalytic domain. This epigenetic mark on chromatin, induced by DNA discontinuities, is now considered as a part of a survival program aimed at protecting primarily chromatin integrity and stability. In this chapter we describe some of our methods for determining in vivo and in vitro PARP-1 activation in response to DNA strand breaks. Poly(ADP-ribosyl)ation is a posttranslational modification of nuclear proteins induced by DNA strand-breaks that contributes to the survival of injured proliferating cells (D'Amours et al., 1999). Poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) now constitute a large family of 18 proteins, encoded by different genes and displaying a conserved catalytic domain in which PARP-1 (113 kDa), the founding member, and PARP-2 (62 kDa) are so far the sole enzymes whose catalytic activity is immediately stimulated by DNA strand-breaks (Ame et al., 2004). PARP-1 fulfils several key functions in repairing an interruption of the sugar phosphate backbone. It efficiently detects the presence of a break by its N-terminal zinc-finger domain; the occurrence of a break is immediately translated into a posttranslational modification of histones H1 and H2B leading to chromatin structure relaxation and therefore to increased DNA accessibility. As an amplified DNA damage signal, auto-poly(ADP-ribosyl)ation of PARP-1 triggers the recruitment of XRCC1, which coordinates and stimulates the repair process, to the DNA damage sites in less than 15 s in living cells (Okano et al., 2003). Although dispensable in a test tube DNA repair experiment, in vivo these three properties positively influence the overall kinetics of a DNA damage-detection/signaling pathway leading rapidly to the resolution of DNA breaks. Accordingly, poly ADP-ribose (PAR) synthesis and the accompanying NAD consumption are now considered as bona fide marks of DNA interruptions in the genome. In this chapter we describe several methods for determining PARP activation in response to the occurrence of DNA breaks in vitro and in vivo. DNS javító mechanizmusok működésbe lépnek

PAR szerkezete ADP-ribóz PAR PAR P A PARP P P A P protein liáz fehérje Foszfo- diészteràz ribóz P PARP A P ribóz PAR- glikozilàz ribóz ADP-ribóz P A P ribóz PAR protein liáz fehérje

PARP szerepe élet/halál PAR (poli-ADP ribóz) jel a mitokondriumnak az apoptózist indukáló faktor (AIF) kibocsátására Nagy ATP igény – ha kiterjedt a DNS sérülése Inaktiválás kaszpáz hasítja  apoptózis Rákos sejtek érzékenyebbek a PARP hiányára mint normál sejtek- PARP inhibítorok rákterápiában használatosak

pl.: prolin racemizáció pl.: hem citokróm C 62

Összefoglalás Enzim kaszkádok aktiválása S/T - Y- COO- N-Ac PAR P P Ubq Ubq Ubq Ubq SUMO Enzim kaszkádok aktiválása PTM– jelképzés a szabályozáshoz lokalizációs degradációs szignálok Lehet: Reverzibilis-irrverzibilis, de mindig egy irányba játszódik le Sejtbéli koncentráció szintek változása

Irodalmak Kevin Ahern's Bite-Sized Biochemistry #15, #16, #18, #19 Oldalak: 275-291, 402, 411-418,586-588,592-595 Bruce Alberts : Essential Cell Biology, Third Edition (ISBN: 9780815341291) 6. fejezet