TRANSZPLANTÁCIÓSIMMUNOLÓGIA LÁNYI ÁRPÁD PhD

AUTOLÓG SZERV, SZÖVET VAGY SEJT TRANSZPLANTÁCIÓ Bőr, izom, dendritikus sejt, porc Hematopoetikus sejtek (HSC) autograft szingraft SZINGÉNALLOGÉN Vese, szaruhártya, máj, szív, tüdő Hematopoetikus sejtek (HSC) allograft

Az első humán vérátömlesztés 1818 NÉHÁNY MÉRFÖLDKŐ A TRANSZPLANTÁCIÓBAN James Blundell brit szülész a szülés során bekövetkező vérveszteség pótlására végzett vérátömlesztést (négy uncia) férj és feleség között. Ez volt az első jól dokumentált vérátömlesztés. Tíz másik nő kapott hasonló okból vérátömlesztést, a módszer sikere 50%-os volt. Photo: Blundell's Gravitator Source: NIH/ Pennsylvania State University Libraries

Az első kísérletek csontvelő átültetésére 1896 Az étkezés után orálisan adott csontvelőt leukémia kezelésére próbálták használni, eredménytelenül. A következő néhány évben, az aplasztikus anémia kezelésére intravénásan adott csontvelővel elértek némi eredményt. Már a 18. században végeztek sikereses (főként) bőrátültetéseket állatokon. Az első sikeres bőr allograft 1869 Jacques Louis Reverdin Pajzsmirigy transzplantáció 1883 Theodor Kocher A pajzsmirigy transzplantáció elindította az új terápiás módszer, a szervátültetés elterjedését. A századforduló körüli évtizedekben számos szerv átültetését kísérelték meg, több-kevesebb sikerrel. Az ABO vércsoportrendszer felfedezése 1902 Karl Landsteiner Az első xenotranszplantáció 1906 Egy francia sebész próbált nyúlvesével segíteni egy veseelégtelenségben szenvedő gyermeken. A gyerek két hétig élt. Négy évvel később egy higany- mérgezésben szenvedő fiatal lány kapott majomvesét. Némi vizelet képződött, de a lány csak öt napig élt. Az első sikeres csontátültetés 1878 Mivel nem volt mód a humán szövetek konzerválására, a módszer nem terjedt el. NÉHÁNY MÉRFÖLDKŐ A TRANSZPLANTÁCIÓBAN

Az MHC felfedezése 1940-es évek George Snell Humán HLA: 1958 Jean Dausset Az első sikeres humán vese szingraft 1954 Joseph E. Murray Az első sikeres humán szívátültetés 1967 „Működik!„ – kiáltotta Dr. Christiaan Barnard, amint a 23 éves, autóbalesetben elhunyt Denise Darvall szíve dobogni kezdett az 54 éves Louis Washkansky mellkasában. A transzplantációt a fokvárosi Groote Schuur kórházban végezték. Washkansky 18 nappal később hunyt el, az immunszupresszió miatt fellépő pneumonia következtében. Az első sikeres csontvelő allograft 1973 Az átültetést New York-ban, a Sloan-Kettering Center-ben végezték. Egy dán férfiből származó csontvelőt ültettek be egy öt éves SCID betegbe. Az ezt megelőző sikeres csontvelő transzplantációkat rokonok között végezték. NÉHÁNY MÉRFÖLDKŐ A TRANSZPLANTÁCIÓBAN

ÁTÜLTETETT SZERVVEL ÉLŐK AZ EGYESÜLT ÁLLAMOKBAN

SZÖVET/SZERV TRANSZPLANTÁCIÓ A transzplantáció sikere főként a hisztokompatibilitástól függ

A SZINGÉN GRAFTOK FENNMARADNAK, MÍG AZ ALLOGRAFTOK KILÖKŐDNEK EGEREKBEN ÉS EMBEREKBEN IS

ALLOGÉN FELISMERÉS

AZ ALLOANTIGÉNEK DIREKT ÉS INDIREKT FELISMERÉSE

AZ ALLOGÉN MHC MOLEKULÁK DIREKT FELISMERÉSÉNEK MOLEKULÁRIS ALAPJA Az allogén MHC molekulák direkt felismerése nagyon erős T-sejt választ indukál. A T-sejt populáció 1-2%-a képes az allogén MHC molekulák direkt felismerésére. Ez a szám X nagyobb, mint infekció esetén. Az MHC molekulák számos különböző, a donor celluláris proteinjeiből származó peptiddel alkothatnak komplexet, ami különböző T-sejt klónok aktivációjához vezet. Minden APC MHC molekulák ezreit expresszálja: ha ezek idegen MHC molekulák, közülük sokat, vagy akár mindet felismerhetik alloreaktív T- sejtek (infekció: %). Számos memória T-sejt keresztreagálhat az allogén MHC molekulákkal.

Alapjaiban a fertőzés során történő antigén felismeréshez hasonlítható. AZ ALLOANTIGÉNEK DIREKT ÉS INDIREKT FELISMERÉSE

AZ ALLOREAKTÍV T-SEJTEK AKTIVÁCIÓJA Graft antigénekre (főként HLA) specifikus ellenanyagok is hozzájárulnak a kilökődéshez. A T-sejt dependens ellenanyag termelés a fertőzések során bekövetkező antitest termeléshez hasonló módon zajlik (az indirekt felismerés egy példája).

GRAFT KILÖKŐDÉS

A LEGGYAKORIBB SZÖVET-TRANSZPLANTÁCIÓ A VÉRÁTÖMLESZTÉS Az inkompatibilitás crossmatch teszttel ellenőrizhető. Recipiens szérum/donor eritrocita A szervátültetéshez elengedhetetlen a vércsoport antigének kompatibilitása A vércsoport antigének inkompatibilitása II-es típusú hiperszenzitivitási reakcióhoz vezet

HIPERAKUT GRAFT KILÖKŐDÉS ANTITEST-MEDIÁLT II-ES TÍPUSÚ HIPERSZENZITIVITÁSI REAKCIÓ Az inkompatibilitás legdramatikusabb formája, percekkel vagy órákkal az átültetést követően Az endoteliális sejtek expresszálják a VÉRCSOPORT ANTIGÉNEKET ANTITESTEK (IgM) – KOMPLEMENT FIXÁCIÓ – NEUTROFIL, TROMBOCITA AKTIVÁCIÓ – INTRAVASCULARIS KOAGULÁCIÓ – IRREVERZIBILIS ISCHAEMIÁS NEKRÓZIS Csak elkerülni lehet, visszafordítani nem!! Manapság az ABO inkompatibilitás következtében fellépő hiperakut kilökődés nem nagyon fordul elő, DE Az endoteliális sejtek HLA I molekuláját felismerő, főként IgG antitestek szintén hiperakut kilökődést okoznak!! Honnan származnak a HLA-specifikus antitestek?

Terhesség (szülés) Egymást követő terhességek során az anti-HLA antitestek szintje nő Vérátömlesztés (trombocita, leukocita) HLA tipizálást nem végeznek, csak az ABO és Rh kompatibilitást ellenőrzik Korábbi szervátültetés Cross-match!!! ANTI-HLA ANTITESTEK KELETKEZÉSE

CROSSMATCH TESZTEK Komplement-dependens citotoxicitás A donor limfocitákat izolálják A recipiens szérumát a donor limfocitáihoz adják A hozzáadott komplement általában nyúlszérumból származik A donor-specifikus antitestek jelenléte a limfociták líziséhez vezet DOI: /j x

Áramlási citometria Érzékenyebb A T- és B- sejtek szeparációja lehetővé teszi az MHCI- és MHCII-specifikus antitestek detektálását Az MHCI-specifikus antitestek a T- és B- sejtekhez is kötődnek Az MHCII-specifikus antitestek csak a B- sejtekhez kötődnek DOI: /j x CROSSMATCH TESZTEK

Panel reaktív antitest (PRA) A páciens szérumának tesztelése a populációt reprezentáló leukocita antigénekkel szemben A pozitív reakciók számát százalékban adják meg DOI: /j x Bb Beads: CROSSMATCH TESZTEK

AKUT GRAFT KILÖKŐDÉS T-SEJT-MEDIÁLT IV-ES TÍPUSÚ HIPERSZENZITIVITÁSI REAKCIÓ Napok vagy hetek alatt alakul ki Th1, Th17, CD8+ T-sejtek, makrofágok Antitestek, komplement, neutrofilek, trombociták A kilökődött graft duzzadt, mélyvörös haemorrhagiás és szürke nekrotikus foltokkal tarkított.

VESE GRAFTSZÍV GRAFT Plazmasejtek T-SEJTEK Limfociták a vesetubulusok körül T limfociták a myocardiumban (CD3+) Limfociták egy arteriola körül (A) A vesetubulusokat körülvevő limfociták (T) CD3 festés ugyanabban a szekcióban (barna) AKUT GRAFT KILÖKŐDÉS T-SEJT-MEDIÁLT IV-ES TÍPUSÚ HIPERSZENZITIVITÁSI REAKCIÓ

KRÓNIKUS GRAFT KILÖKŐDÉS III-AS TÍPUSÚ HIPERSZENZITIVITÁSI REAKCIÓ E: endotélM: makrofág G: granulocitaEL: elasztikus réteg T: alloreaktív TSMC: simaizomsejt Az érfalak megvastagodása, az érlumen beszűkülése Megvastagodott falú artéria egy kilökődött vese graftban

A GRAFT-TÚLÉLÉS ÖSSZEHASONLÍTÁSA ÉLŐ ÉS NEM- ÉLŐ DONOROS VESEÁTÜLTETÉST KÖVETŐEN /numonthly.12182

A HLA AZONOSSÁG JAVÍTJA AZ ÁTÜLTETETT SZERVEK (ITT:VESE) TÚLÉLÉSI ESÉLYEIT Kék Narancs Piros Sötétkék Zöld Fekete Barna A HLA-DR, B és A egyezés a legfontosabb

HLA TIPIZÁLÁS

KEVERT LIMFOCITA REAKCIÓ Az alloreaktív T-sejtek idegen MHC-ra adott válasza in vitro analizálható

HLA TIPIZÁLÁS DNS-ALAPÚ TIPIZÁLÓ MÓDSZEREK PCR-SSOPH: Szekvencia-specifikus oligonukleotid próba hibridizáció TAGCGAT ATCGCTA TAGAGAT ATCTCTA Minta 1 (A*0203) Minta 2 (A*0501) Minta 1 (A*0203) Minta 2 (A*0501) Amplifikáció, denaturáció, felvitel a memránra Minta 1 Minta 2 Hibridizáció allél-specifikus próbával...TAGCGAT..(A*02)...TAGAGAT…(A*05) Specimen 1 Specimen 2 Specimen 1 Specimen 2 Közepes feloldású Potenciális donorok azonosítása, páciensek „előtesztelése” Nagy áteresztőképesség, viszonylag olcsó

SSP-PCR: Szekvencia-specifikus PCR (allél-specifikus primerek) Kontroll Allél-specifikus termék SSP: Szekvencia-specifikus primer Nincs amplifikáció SSP Amplifikáció SSP kötődés Nincs SSP kötődés Kontroll Allél-specifikus termék Agaróz gél Reagens kontroll Nagyon gyors teszt, 3-4 órát vesz igénybe Általában halott donorok tipizálására használják A különböző allélokra specifikus primerek elérhetők 96 lyukú lemezre vitt formátumban HLA TIPIZÁLÁS DNS-ALAPÚ TIPIZÁLÓ MÓDSZEREK

SBT: Szekvencia-alapú tipizálás A polimorf régiók amplifikációját szekvenálás követi A legnagyobb feloldású HLA tipizáló módszer Forward PCR primer Szekvenáló primerek Reverz PCR primer A kapott szekvenciák összehasonlítása a referencia szekvenciákkal HLA TIPIZÁLÁS DNS-ALAPÚ TIPIZÁLÓ MÓDSZEREK

MÉG A TELJES HLA AZONOSSÁG SEM BIZTOSÍTJA A GRAFT TÚLÉLÉSÉT MINOR HISZTOKOMPATIBILÁSI ANTIGÉNEK A polimorf celluláris proteinekből származó peptidek az MHCI molekulákhoz kötődnek A minor H antigének által indukált reakció a vírusellenes immunválaszhoz hasonló

MINOR HISZTOKOMPATIBILITÁSI ANTIGÉNEK

IMMUNSZUPRESSZÍV TERÁPIA

DEPLETÁLÓ ANTITESTEK A depletáló antitesteket általános immunszupresszánsként a transzplantációt megelőzően és azt követően is használják. Nyúl antitimocita globulin (rATG) Nagy affinitású poliklonális antitestek keveréke T-, B-, NK, dendritikus és endoteliális sejtekhez kötődik Komplement fixáció, fagocitózis Szérumbetegség Alemtuzumab: anti-CD52 CD52-specifikus humanizált patkány monoklonális IgG A CD52-t majdnem minden limfocita, a makrofágok és a dendritikus sejtek is expresszálják Az Alemtuzumab hosszútávú limfopeniát indukál

KORTIKOSZTEROIDOK Hatékony immunszupresszánsok A transzplantációt megelőzően és a kilökődési epizódok során használják Az IKB-n keresztül gátolja az NFkB aktivitást (a gyulladásos válasz központi transzkripciós faktora) Gátolják a limfociták másodlagos nyirokszervekbe való belépését Számos káros mellékhatása van: folyadékvisszatartás, súlynövekedés, diabetes, a csont ásványi anyag tartalmának csökkenése, a bőr elvékonyodása Hosszútávú használata kerülendő

Kalcineurin inhibitorok: cyclosporin, tacrolimus Mellékhatások: Neurotoxicitás, Nefrotoxicitás, Diabetes T-SEJT AKTIVÁCIÓT GÁTLÓ IMMUNSZUPRESSZÁNSOK

A CYCLOSPORIN GRAFT TÚLÉLÉSRE GYAKOROLT HATÁSA

A KO-STIMULÁCIÓ GÁTLÁSA: BELATACEPT A belatacept a már bevált szerekhez hasonlóan hatékonyan gátolja a T-sejt választ, emellett nem okoz vesekárosodást. Ugyanakkor használata során gyakoribbak a kilökődési epizódok.

AZ IL-2 JELÁTVITEL GÁTLÁSA Kiméra basiliximab, humanizált daclizumab: CD25-specifikus monoklonális IgG1 antitestek A transzplantáció előtt és az azt követő első két hónapban alkalmazzák, amikor az akut kilökődés esélye a legnagyobb. 24 órán belül telíti az összes CD25-öt, félélet- ideje 2 hét, hatása több, mint egy hónapig tarthat. Az aktivált T-sejtekre specifikus, nem okoz széles körű immunszupressziót.

AZ IL-2 JELÁTVITEL GÁTLÁSA Rapamycin (sirolimus) Immunszupresszív makrolid (Streptomyces hygroscopicus) Az FKBP12-höz kötődik, de nem kalcineurin inhibitor mTOR inhibitor, gátolja az IL-2 receptor jelátvitelt Toxikusabb, mint a cyclosporin vagy a tacrolimus, kombinált terápiában használják Nem gátolja jelentősen a Treg funkciókat Dendritikus sejtek, B-sejtek doi: /S (98)

REPLIKÁCIÓT ÉS PROLIFERÁCIÓT GÁTLÓ CITOSZTATIKUMOK Citotoxikus szereket csak a transzplantációt követően alkalmaznak Azathioprin: veseátültetés Inaktív „prodrug”, 6-merkaptopurin-ná majd 6-tioinozinsav-vá konvertálódik Az utóbbi gátolja az adenin és guanin bioszintéziséhez szükséges inozinsav képződését Nem szelektív, károsítja az aktívan osztódó szöveteket: csontvelő, intestinalis epitelium, hajtüsző: anémia, leukopénia, trombocitopénia, bélkárosodás, hajvesztés Mycophenolat-mofetil: Penicillium stoloniferum Az azathioprin-hez hasonló hatás A májban mikofenolsavvá metabolizálódik A guanin szintézishez szükséges inozin-monofoszfát- dehidrogenázt gátolja

Citotoxikus szereket csak a transzplantációt követően alkalmaznak Cyclophosphamid: Vegyi fegyvernek alkották (1. vh) Foszforamid mustár-rá metabolizálódik ami erős alkiláló szer, keresztköti a DNS-t Károsítja a húgyhólyagot, rákot vagy hólyaggyulladást (haemorrhagias cystitist) okozhat Az azathioprin-től eltérően, a ciklofoszfamid nem különösebben káros a májra, alternatíva lehet a májkárosodott páciensek számára Rövid idejű, repetitív alkalmazás a leghatékonyabb Methotrexate: A timidin szintézishez szükséges dihidrofolát-reduktáz-t gátolja REPLIKÁCIÓT ÉS PROLIFERÁCIÓT GÁTLÓ CITOSZTATIKUMOK

ÖSSZEFOGLALÁS: AZ EGYES IMMUNSZUPRESSZÁNSOK A T- SEJT AKTIVÁCIÓ KÜLÖNBÖZŐ FÁZISAIBAN FEJTIK KI HATÁSUKAT

A CÉL: DONOR-SPECIFIKUS TOLERANCIA Hematopoetikus kimérák létrehozása A méhen belüli fejlődés során közös vérkeringéssel rendelkező kétpetéjű ikrek toleránsak egymás szöveteivel szemben. A szervátültetés HSCT-vel való kombinációja elősegíthetné egy stabil tolerancia kialakulását,hosszútávú immunszupresszió nélkül Bíztató eredmények: vese/csontvelő allograftok Haploidentikus családtagok Nem-mieloablatív kondicionálás: cyclophosphamid, cyclosporin, anti- CD2 antitest, tímusz besugárzás Az immunszupresszív terápia 9–14 hónap után elhagyható volt Túlélés: 10 év Treg transzfer Donor-specifikus T-regek előállítására és transzplantációs terápiában való felhasználására vonatkozó klinikai kísérletek folyamatban vannak.

A HLA AZONOSSÁG ÉS AZ IMMUNSZUPRESSZIÓ IGÉNYE NEM MINDEN SZÖVET/SZERV ESETÉBEN EGYFORMA Anterior kamra-asszociált immundeviáció (ACAID) Anti-inflammatorikus, de a patogénnekkel szembeni védelmet fenntartó környezet A szaruhártya nem vaszkularizált Az anterior kamra immunmodulátor faktorokat tartalmaz (TGF-β) Tolerogén DC-k, Tregek, IL-4, TGF-β. Szaruhártya átültetés: 90%-os siker HLA azonosság hiányában, immunszupresszív terápia nélkül Máj Speciális szerkezet és érhálózat A HLA I nagyon alacsonyan expresszálódik, HLA II nincs Az emésztőrendszerrel való szoros kapcsolata miatt rengeteg nem saját antigén jut be a májba (tolerogénebb mikrokörnyezet) A kilökődés ritkább, mint más szervek esetében HLA tipizálás, cross-match nem előzi meg az átültetést, vércsoport ellenőrzés van Cyclosporin, tacrolimus kezelés javítja a sikeres transzplantáció esélyét A spektrum másik oldalán helyezkedik el a csontvelő

HEMATOPOETIKUS ŐSSEJT TRANSZPLANTÁCIÓ

HEMATOPOETIKUS ŐSSEJT TRANSZPLANTÁCIÓ (HSCT) Mieloablatív terápia: citotoxikus szerek és besugárzás kombinációja Engraftment: a pluripotens őssejtek kolonizálják a csontokat Az immunrendszer rekonstitúcióját követően (egy év vagy több) a páciens kiméra lesz (genetikailag eltérő immunrendszer) Hematopoetikus őssejtek már a vérből is kinyerhetők G-CSF, GM-CSF: az őssejtek kiűzése a csontvelőből Leukaferezis Izoláció: CD x10 9 CD34+ sejt szükséges a gyors engraftmenthez

MINÉL NAGYOBB HLA AZONOSSÁG, ANNÁL ERŐTELJESEBB T-SEJT VÁLASZ

A HSCT SIKERE KORRELÁL AZ MHC AZONOSSÁGGAL

GRAFT-VERSUS-HOST BETEGSÉG: ALLOREAKTÍV DONOR T- SEJTEK MEGTÁMADJÁK A RECIPIENS SZÖVETEIT A HLA azonosság esetén kialakuló GVHD-t a minor hisztocompatibilitási antigének indukálják A mieloablatív terápia során egyéb szövetek is sérülnek: bőr, intestinalis epitelium, hepatociták Citokin vihar, dendritikus sejt aktiváció A recipiens dendritikus sejtjei aktiválják a donor alloreaktív T-sejtjeit Methotrexate cyclosporin-nal kombinálva A GVHD növeli a sikeres engraftment esélyét

A köldökzsinórvér hematopoetikus őssejtekben gazdag, alloreaktív T-sejtekből pedig keveset tartalmaz Kevésbé súlyos GVHD, nagyobb HLA eltérés tolerálható Az engraftment lassúbb Mennyisége limitált: két nem rokon donorból származó minta kombinációja használatos A páciens hematopoetikus rendszere kiméra lesz, de idővel az egyik donorból származó sejtek lesznek a dominánsak Először 1988-ban alkalmazták a módszert egy Fanconi anémiában szenvedő gyerek kezelésére Azóta több, mint 25,000 ilyen jellegű transzplantációt végeztek KÖLDÖKZSINÓRVÉR, MINT A HEMATOPOETIKUS ŐSSEJTEK FORRÁSA

NÉHÁNY HSCT-VEL KEZELHETŐ ÖRÖKLŐDŐ BETEGSÉG HSCT-vel számos örökletes immundeficiencia is kezelhető, például SCID.

HSCT A TUMOR TERÁPIÁBAN Autolog HSCT Az ablatív kezelés előtt mintát vesznek a csontvelőből. A tumorsejteket eltávolítják a mintából és az ablatív terápiát követően a hematopoetikus őssejteket visszajuttatják a páciensbe. Perfekt hisztokompatibilitás: nincs GVHD, nincs szükség immunszupresszióra Autolog graft esetén a betegség kiújulásának esélye nagyobb, mint allogén graftoknál

GRAFT-VERSUS-LEUKÉMIA (GVL) EFFEKT A donor alloreaktív T-sejtjei megtámadják a recipiens tumorsejtjeit Kisebb hangsúlyt fektetnek a tumorsejtek eliminációjára, GVL reakciót elősegítő terápia Nem-mieloablatív kondicionáló terápia Donor T-sejtek transzfúziója a transzplantációt követő olyan időpontban, amikor a kondicionáló terápia egyéb szövetekre gyakorolt hatása már elmúlt, így a GVHD valószínűsége kisebb.

Haploidentikus graft NK SEJT-MEDIÁLT GVL EFFEKT GVHD megelőzés: T-sejt depléció, anti-T-sejt antitest infúzió A transzplatációt követően nincs immunszupresszív terápia Az NK sejtek hamarabb megjelennek, mint a T- sejtek, ezek között alloreaktív NK sejtek is lehetnek Az inhibitor KIR receptorok és a HLA-B/C közötti interakciók által meghatározott NK sejt-mediált alloreakciók előfordulása és specificitása a donor és a recipiens HLA típusa alapján prediktálható NK sejtes alloreakciók akkor történnek, amikor a recipiens sejtjei kevésbé gátolják az NK sejteket, mint a donor sejtjei. AML+, ALL- Az alloreaktiv NK válasz idővel gyengül, az immunrendszer rekonstitúcióját követően pedig az NK-sejtek toleránsak lesznek mind a recipiens, mind a donor sejtekkel szemben.

KÖSZÖNÖM A FIGYELMET