2008 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien

Az előadások a következő témára: "2008 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien"— Előadás másolata:

1 2008 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien
The Nobel Prize in Chemistry 2008 was awarded jointly to Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP".

2 16 évesen túlélte Nagasaki bombázását
1928, Kyoto, Japán 16 évesen túlélte Nagasaki bombázását Gyógyszerészetet (BSc) majd szerveskémiát (MSc, PhD) tanult Japánban 1960-tól a Princeton egyetemen az Auquorea Victoria medúza biolumineszenciájáért felelős fehérjéket kereste, és meg is találta: aequorin (blue luminescent protein) és GFP (green fluorescent protein) több tonna medúzát dolgozott fel 1972, GFP kromofór csoportjának jellemzése (nem kofaktor, hanem a fehérje egy részlete) 1995, aequorin szerkezetének meghatározás Osamu Shimomura biolumineszencia: élő szervezet által keltett fény emissziója, a kemilumineszencia egy fajtájta, amikor egy kémiai reakció következtében fénykibocsátás történik. Pl. a luciferin (pigment) oxigénnel reagálva fényt bocsát ki, a reakciót a luciferáz katalizálja. kromofór: a molekulaszerkezeten belül az a rész, ami a molekula színéért felelős; általában konjugált kettőskötésrendszert tartalmaz.

3 Biokémiát tanult a Harvard egyetemen (PhD)
1947, Chicago, USA Biokémiát tanult a Harvard egyetemen (PhD) 1982-től a Columbia Egyetemen a C. elegans férgek érintésérzékelésével foglalkozik 1992: Douglas Prascher izolálta a gfp cDNS-ét 1992-ben sikeresen klónozzák E. coli-ba és C.elegans-ba a gfp gént, és a fehérje fluoreszkált 1994: Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression, Science recGFP: fehérje-interakció vizsgálatott tette lehetővé unstable GFP: fehérje degradáció tanulmányozása Martin Chalfie cDNS: komplementer DNS, ami az érett mRNS-ről íródik vissza, és már nem tartalmazza a nemkódoló intron szakaszokat. A bakteriális kifejesztetésnek előfeltétele, hogy ne legyenek a DNS-ben intron részek, ezért van szükség a cDNS előállítására.

4 2002: DsRED (red fluorescent protein) felfedezése és jellemzése
1952, New York, USA Harvard egyetemen fizika-kémia szakos, majd Cambridge-ben doktorizik fiziológiából 1994: kimutatta, hogy a GFP kromofór csoportja oxigén hatására spontán kialakul A GFP fluoreszcenciájának optimálásával foglalkozik különböző mutánsokat hozva létre 2002: DsRED (red fluorescent protein) felfedezése és jellemzése 2002- monomer DsRED alapján különböző színű fehérjék előállítása 2010: SOG (singlet oxigene generator protein) elektromikroszkópos jelölésnél használható Roger Y. Tsien

5 Aequorin Fotoprotein Mechanizmus: 22 kDa apoprotein (191 aminosav)
luciferin prosztetikus csoport Mechanizmus: Ca2+ kötés hatására konformációs változás, a luciferin oxidálódik, majd a legerjesztődés során fényt bocsát ki PDB: 1EJ3 Ca2+ Coelenteramide + hn (469 nm) Coelenterazine Coelenteramide*

6 Aequorin Felhasználás Előnyök Hátrány sejtes Ca2+ szint mérés
a klónozott sejtek csak az apoproteint képesek előállítani, a luciferint külön kell a mintához adni Előnyök nincs autofluoreszcencia nem zavarja a sejtműködést Hátrány a luciferint folyamatosan kell adagolni, és az oxidálódott forma nem nyerhető vissza PDB: 1EJ3

7 Vad típusú GFP Fluoreszcens fehérje (nem fotoprotein) Mechanizmus
27 kDa (238 aminosav) nincs benne kofaktor, prosztetikus csoport a fehérje tartalmazza a kromofór csoportot Mechanizmus gerjesztő hullámhossz: 395 nm és 475 nm (UV,V) emisszió: 509 nm (zöld) PDB: 1EMA invazív: roncsoló, visszafordíthatatlan károsodást okoz a vizsgált objektumban 2.4 nm átmérő, 4 nm hosszú, b-hordó 11 béta redő, körülölel egy hélixet, ami a kromofór csoportot tartalmazza, a hordó megvédi a kromofórt a víztől, így a kisöléstől is.

8 Vad típusú GFP Előnyök: Hátrányok: monomer formában aktív
nem kell hozzáadni kofaktorokat nem invazív a detektálása fúziósfehérjeként is alkalmazható, a fúziós partner megtartja a funkcióját örökíthető Hátrányok: a szövetek nem átlátszóak a zöld fényre nézve nem elég intenzív a fénye pH és só érzékeny nem elég stabil szobahőn PDB: 1EMA invazív: roncsoló, visszafordíthatatlan károsodást okoz a vizsgált objektumban célok: piros szín áthatol a szöveteken, a zöld az nem – in vivo imiginghez ez szükséges

9 GFP kromofór csoport p- hidroxibenzilidénimidazolidinon
H2O2 melléktermék p- hidroxibenzilidénimidazolidinon

10 GFP kromofór csoport 11 szálas béta-hordó szerkezet PDB: 1EMA
a denaturált fehérje elveszíti a fluoreszcenciát 11 szálas béta-hordó szerkezet PDB: 1EMA

11 Tovább fejlesztett GFP-k
S65T: intenzívebb fluoreszcencia, nagyobb fotostabilitás, eltolódott gerjesztési hullámhossz F64L: nagyobb termostabilitás Y66W, Y66H: kék szín T203Y: sárgás szín A206K: dimerizáció megakadályozása

12 Tovább fejlesztett GFP-k
Korallok színéért felelős kromofór csoport hasonlít a GFP kromofórhoz. DsRed fehérje tertramer mutációkkal monomerré alakítható GFP DsRed

13 Tovább fejlesztett GFP-k

14 Fluoreszcens fehérjék felhasználása
Génexpressziós szint és fehérjelokalizáció követése in vivo Douglas Prascher 1992-ben sikeresen klónozta a gfp gént.

15 Fluoreszcens fehérjék felhasználása
Génexpressziós szint és fehérjelokalizáció követése in vivo Promóter régióhoz kapcsolva a fehérje kifejeződés időpontjáról és helyéről ad információt Egy célfehérjéhez kötve annak útjáról és élethosszáról ad számot

16 Fluoreszcens fehérjék felhasználása
Fehérje-fehérje interakciók vizsgálata Cameleon konstrukció FRET: Fluoreszcens / Förster Rezonancia Energia Transzfer

17 Fluoreszcens fehérjék felhasználása
Fehérje-fehérje interakciók vizsgálata Cameleon konstrukció Hosszú távú, folyamatos Ca2+ szint detektálás Összetett szöveti környezetben is precízen alkalmazható Bármilyen neuron aktivitásmérésére használható Calcium imaging has potential for both investigating the molecular mechanisms that underlie calcium flux and regulation and visualizing the activity of excitable cells by monitoring the calcium responses.  Cameleon (Miyawaki et al., 1997), a genetically encoded calcium indicator, facilitates calcium imaging in experimental organisms with powerful genetics.  We are using cameleon in C. elegans to study the molecular mechanisms involved in muscular calcium transients and are working to extend the technique to the visualization of neural activity.  For details, see (Kerr et al., 2000).  Shown here is a movie illustrating the visualization of calcium transients in the C. elegans pharyngeal muscle. Calcium transients in the pharyngeal muscle of an intact Caenorhabditis elegans

18 Fluoreszcens fehérjék felhasználása
Fehérje-fehérje interakciók vizsgálata Csak abban a sejtben lesz fluoreszcens jel, ahol a két fehérje találkozik egymással.

19 Fluoreszcens fehérjék felhasználása
Sejtciklus jelzése YFP és mCherry jelölőkkel Zöld: mitózis; Piros: köztesfázis (interphase)

20 Fluoreszcens fehérjék felhasználása
Jóindulatú és rosszindulatú tumorok elkülönítése If tagged cells from a benign tumor line (e.g. NMuMG) are transplanted into an animal, the tumor initially looks yellow at low magnification (Figure 17) because it contains a mixture of green- and red-fluorescing cells. Over several days, the tumor shifts to all red, telling us that the cells have stopped dividing, which is why the tumor is benign. If tagged cells from a malignant tumor line (e.g. HeLa) are similarly transplanted, the tumor persists in its yellow color. Jóindulatú daganat Rosszindulatú daganat

21 Fluoreszcens fehérjék felhasználása

22 Brainbow In the Brainbow mice, the Harvard researchers have introduced genetic machinery that randomly mixes green, cyan and yellow fluorescent proteins in individual neurons thereby creating a palette of ninety distinctive hues and colors. "The technique drives the cell to switch on fluorescent protein genes in neurons more or less at random," says Jean Livet, the postdoctoral researcher responsible for most of the laboratory work that resulted in the Brainbow mice. "You can think of Brainbow almost like a slot machine in its generation of random outcomes." Nature, 2007

23 Felhasznált irodalom

24 2010 Richard F. Heck Ei-ichi Negishi Akira Suzuki
The Nobel Prize in Chemistry 2010 was awarded jointly to Richard F. Heck, Ei-ichi Negishi and Akira Suzuki "for palladium-catalyzed cross couplings in organic synthesis".

25 2009 Thomas A. Steitz Ada E. Yonath Venkatraman Ramakrishnan
The Nobel Prize in Chemistry 2009 was awarded jointly to Venkatraman Ramakrishnan, Thomas A. Steitz and Ada E. Yonath "for studies of the structure and function of the ribosome".

26 2008 Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien
The Nobel Prize in Chemistry 2008 was awarded jointly to Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP".

27 2007 Gerhard Ertl The Nobel Prize in Chemistry 2007 was awarded to Gerhard Ertl "for his studies of chemical processes on solid surfaces".

28 2006 Roger D. Kornberg The Nobel Prize in Chemistry 2006 was awarded to Roger D. Kornberg "for his studies of the molecular basis of eukaryotic transcription".

29 2005 Richard R. Schrock Yves Chauvin Robert H. Grubbs
The Nobel Prize in Chemistry 2005 was awarded jointly to Yves Chauvin, Robert H. Grubbs and Richard R. Schrock "for the development of the metathesis method in organic synthesis".

30 2004 Aaron Ciechanover Avram Hershko Irwin Rose
The Nobel Prize in Chemistry 2004 was awarded jointly to Aaron Ciechanover, Avram Hershko and Irwin Rose "for the discovery of ubiquitin-mediated protein degradation".

31 2003 Roderick MacKinnon Peter Agre
The Nobel Prize in Chemistry 2003 was awarded "for discoveries concerning channels in cell membranes" jointly with one half to Peter Agre "for the discovery of water channels" and with one half to Roderick MacKinnon "for structural and mechanistic studies of ion channels".

32 2002 John B. Fenn Koichi Tanaka Kurt Wüthrich
The Nobel Prize in Chemistry 2002 was awarded "for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules" with one half jointly to John B. Fenn and Koichi Tanaka "for their development of soft desorption ionisation methods for mass spectrometric analyses of biological macromolecules" and the other half to Kurt Wüthrich "for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution".

33 2001 William S. Knowles Ryoji Noyori K. Barry Sharpless
The Nobel Prize in Chemistry 2001 was divided, one half jointly to William S. Knowles and Ryoji Noyori "for their work on chirally catalysed hydrogenation reactions" and the other half to K. Barry Sharpless "for his work on chirally catalysed oxidation reactions"

34 2000 Alan J. Heeger Alan G. MacDiarmid Hideki Shirakawa
The Nobel Prize in Chemistry 2000 was awarded jointly to Alan J. Heeger, Alan G. MacDiarmid and Hideki Shirakawa "for the discovery and development of conductive polymers".

35 1999 Ahmed H. Zewail The Nobel Prize in Chemistry 1999 was awarded to Ahmed Zewail "for his studies of the transition states of chemical reactions using femtosecond spectroscopy".