Pál Gábor, ELTE TTK Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék

Az előadások a következő témára: "Pál Gábor, ELTE TTK Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék"— Előadás másolata:

1 Pál Gábor, ELTE TTK Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék
Molekuláris kölcsönhatás labor létrehozása az ELTE TTK Biológiai Intézetében Pál Gábor, ELTE TTK Biológiai Intézet, Biokémiai Tanszék Kedvezményezett: Eötvös Loránd Tudományegyetem 1053 Budapest, Egyetem tér 1-3. Tel: KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

2 Molekuláris szinten még a legegyszerűbb élőlények is rendkívül összetettek
Lipopoliszacharidok Fehérje Riboszóma E. coli mRNS tRNS DNS Foszfolipid Lipoprotein Peptidoglikán Flagellum KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

3 Minden életműködés molekulák kölcsönhatásán keresztül valósul meg
Ezek közül legalább az egyik kölcsönható partner makromolekula fehérje-DNS fehérje-fehérje fehérje-peptid fehérje-kismolekula KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

4 Az emberi fehérjék kölcsönhatási hálózata
KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

5 Legfontosabb kérdések:
Mi kötődik mihez? Milyen gyorsan alakul ki a kapcsolat? Mennyi ideig marad fenn a kapcsolat? Milyen „erős” a kölcsönhatás? Egy-egy kölcsönhatás szelektív blokkolása új gyógyszerek kifejlesztését eredményezheti! KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

6 Molekuláris kölcsönhatások mérése
felületi plazmon rezonancia (SPR) módszerével Áramlási cella Evaneszcens mező 500 nm Plazmon hullám Aranyréteg 100% Prizma  Visszavert fény százaléka Az intenzitás minimumhoz tartozó szög lineárisan függ az aranyrétegen felhalmozódó molekulák össztömegétől. Jel = SPR minimum eltolódás 0% Visszavert fény szöge KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

7 Áramlás Valósidejű mérés a molekulák speciális jelölése nélkül
Áramlási cella Áramlás 500 nm Stacionárius állapot Kötődés Szétválás KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

8 Összetett komplexek kialakulásának vizsgálata SPR módszerrel
Site1 kötés: kétmolekulás SPR Site2 kötés: három-molekulás SPR Vizsgálhatóvá vált az összes kölcsönhatási felszín: Pál et al PNAS 2003 KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

9 egyszerre akár 36 kölcsönhatás egyidejű mérése
ProteOn XPR36 készülék egyszerre akár 36 kölcsönhatás egyidejű mérése A hazai felsőoktatási / akadémiai intézetekben egyedülálló KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

10 A készülék specialitása: keresztezve elrendezett áramlási cellák
6x6 KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

11 6 eltérő, felületre-kötött molekula
6 eltérő, injektált molekula 1-féle injektált molekula “6 x 6” (Multiplex szkrínelés) “36 x 1” (nagy áteresztőképességű szkrínelés) KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

12 Az SPR készülék fő felhasználási területei:
makromolekula-makromolekula kölcsönhatások kinetikai mérése egyszerre több tíz mintahelyen példák: ellenanyagok kölcsönhatása peptid vagy fehérje antigénekkel enzimek kölcsönhatása nagyméretű gátlószerekkel Fő előnyök: a molekulákat nem kell optikai jellel ellátni összetett, sok-résztvevős komplexek kialakulása is mérhető Fő korlátok: az egyik molekulát felülethez kell rögzíteni kismolekulák vizsgálatára kevéssé alkalmas KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

13 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader
Oldatfázisú molekuláris kölcsönhatások vizsgálata „multireader” készülékkel Hybrid Multi-Mode Microplate Reader KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

14 Mérési módok Abszorbancia (UV és látható) Fluoreszcencia intenzitás Fluoreszcencia polarizáció Lumineszcencia Időfelbontásos fluoreszcencia AlphaScreen/AlphaLISA (Alpha = Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

15 Fluoreszcencia polarizációs mérés
kisméretű, fluoreszcensen jelölt molekulák kötődése nagyméretű molekulához oldatfázisban gyorsan forgó, fluoreszcensen jelölt kismolekula depolarizált kibocsátott fény polarizációs szűrő depolarizált gerjesztőfény polarizált gerjesztőfény polarizált kibocsátott fény lassan forgó, makromolekuláris komplex KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

16 A „multireader” készülék fő felhasználási területei:
makromolekula-kismolekula kölcsönhatások mérése oldatban, egyszerre akár több száz mintahelyen példák: Enzimkatalizált kémiai reakciók mérése Enzimek és gátlószerek kölcsönhatásának mérése Makromolekulák és kisméretű, jelölt molekulák kölcsönhatásának mérése Fő előny: a mérés oldatban zajlik Fő korlát: az egyik molekulát rendszerint fluoreszcensen jelölni kell KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n

17 Összefoglalás: A ~ 100 millió forintos beruházásból beszerzett műszerek kiegészítik egymást A két műszer együttesével olyan világszínvonalú laboratórium jött létre, amely univerzálisan alkalmas felületi és oldatfázisú molekuláris kölcsönhatások nagy áteresztőképességű vizsgálatára. A laboratórium alapkutatások és alkalmazott kutatások végzésére egyaránt alkalmas, és támogatja a mesterszakos és doktorandusz hallgatók képzését is KMOP-4.2.1/B Interdiszciplináris, innovatív kutatási irányok és az ipari kooperáció infrastrukturális hátterének fejlesztése valamint új oktatási technológiák bevezetése az ELTE-n