vagy a főoldalon keresztül (immunology.unideb.hu) belejentkezve:

Az előadások a következő témára: "vagy a főoldalon keresztül (immunology.unideb.hu) belejentkezve:"— Előadás másolata:

1 Az oktatott anyagok megtalálhatóak lesznek (korábbi évek már megtalálhatók):
vagy a főoldalon keresztül (immunology.unideb.hu) belejentkezve: username: student pw: download Letöltések _II régiek: archívum (2010-…) A képanyagok megjegyzés része sok esetben az értelmezést megkönnyítő magyarázatot tartalmaz (pl. akronímák/betűszavak jelentése) számonkérés Biotechnológusok Mol.Biológusok

2 ANTIGÉN, ELLENANYAG immunogenitás, tolerogenitás antigén fogalma
epitop (B-, T-sejt epitop) haptén hordozó antigén prezentáció T independens antigének szuperantigének immunoglobulinok ellenanyag szerkezete izotípusok ellenanyagok funkciói poliklonális és monoklonális ellenanyagok passzív immunizálás humanizált ellenanyagok ellenanyagok felhasználása gyakorlat: monoklonális ellenanyag termelő hibridóma sejt előállítása sejtszámolás gyorsklónozás ellenanyagok tisztítása affinitás oszlopon

3 ANTIGÉN IMMUNOLÓGIAI FOGALOM
Az adaptív immunválasz fogalomkörébe tartozik, B-, T-limfocitákkal, antigén receptorokkal, ellenanyagokkal kapcsolatban beszélünk antigénről. Szinte bármilyen kémiai szerkezet ((de olyan anyagok amik képesek fehérjékkel másodlagos kémiai kötést kialakítani!)) Oldott vagy részecske természetű Egyszerű vagy összetett Szervezetben képződő vagy külső környezetből bejutó Genetikailag saját vagy nem saját Természetes vagy mesterséges

4 DEFINÍCIÓK Antigén (Ag) - bármely olyan anyag, amelyet az érett immunrendszer felismer és vele szemben specifikus, fajlagos módon reagál (antigén receptor ismeri fel) Antigenitás – az antigén specifikus kötődési képessége az antigén receptorhoz vagy ellenanyaghoz: immunogenitás – az antigén képessége az (adaptív) immunválasz beindítására tolerogenitás – az antigén képessége az immunológiai tolerancia kiváltására, specifikus „immun-nemválaszolás” (jellemzően ilyenek pl. a saját antigének)

5 AZ IMMUNOGENITÁST BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK I.
A szervezet szempontjából: Genetikai háttér (idegen/saját) faji hovatartozás (filogenetikai távolság: rokon fajoknak hasonlóak a fehérjéi) egyéni különbségek (pl. MHC molekulák eltérései) Életkor (újszülött – még nincsenek reagáló sejtjei, időskor – nem képződnek új limfociták) A szervezet fiziológiai állapota (pl. immunodefficiencia, éhezés) MHC molekula (major histocompatibility gene complex) különféle sejtek felszínén a peptid antigéneket a T sejtek számára megmutató molekula immuno/immundefficiencia – az immunrendszer elégtelen, hiányzó működésével kapcsolatos betegség

6 AZ IMMUNOGENITÁST BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK II.
Az antigén szempontjából: Az antigén fizikai-kémiai sajátságai méret/komplexitás (nagyobb antigéntöbb epitóp, „hordozó” szerepe) korpuszkuláris (sejt, kolloid) vagy oldott állapot denaturált vagy natív (epitópok!) lebonthatóság, feldolgozhatóság (antigén prezentáció APC által) Hozzáférhetőség (saját szemlencse krisztallin fehérjék elzártak az immunrendszertől) APC – antigen presenting cell, az antigént a T sejtnek bemutató sejt (lehet szinte bármilyen sejt, vagy speciális „professzionális antigén prezentáló sejt” A crystallin fehérjék immunogének lehetnek, ha kapcsolatba kerülnek az adaptív immunrendszerrel

7 AZ IMMUNOGENITÁST BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK III.
Immunizálási szempontból: Dózis Bevitel módja és útja Intradermális/szubkután > intravénás > orális > intranazális (a sorrend függ az antigéntől is!) Adjuvánsok fokozzák az immunrendszer antigén ingerre adott válaszát, de maguk nem immunogének pl: aluminiumsók, Freund-adjuváns, TLR ligandumok AZ ADJUVÁNS HATÁS ÖSSZETETT: depó hatás  az antigén hosszantartó jelenléte a természetes immunitás aktiválása járulékos sejtek aktivációja TLR – toll-like receptor

8 A B- és T-sejtek antigén felismerése
(animált ábra) A B- és T-sejtek antigén felismerése Ellenanyagok (szérum Ig) APC Antigén MHC BCR (membrán Ig) TCR APC – antigén prezentáló (bemutató) sejt T B B sejtek natív antigént ismernek fel T sejtek feldolgozott antigént ismernek fel

9 (animált ábra) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál (felismerés antigén receptorokkal, ellenanyagokkal) Antigén Antigén determinánsok avagy epitopok: az antigén azon részei amihez az antigén receptorok vagy az antigén specifikus ellenanyagok közvetlenül kötődnek (másodlagos kémiai kötőerők)

10 Antigén determináns avagy epitop
Az antigénnek az antigén receptorhoz közvetlenül kapcsolódni tudó része Az antigén azon része, melyet egy meghatározott immunglobulin (B sejt receptor vagy ellenanyag) vagy T sejt receptor ismer fel. T sejt epitopok esetében az antigén fehérjéből származó peptid egyes aminosavainak oldalláncairól szoktunk beszélni, de maga a T sejt receptor a megfelelő MHC molekulával (az MHC fehérje megfelelő pozíciójában levő aminosav oldalláncokkal) is kialakít kölcsönhatásokat. együtt!

11 B sejt epitop T sejt epitop (B sejtek ismerik fel) fehérjék
szénhidrátok lipidek nukleinsavak szteroidok mesterséges vegyületek stb. sejtfelszíni, szöveti(kötött) vagy oldott (T sejtek ismerik fel) peptidek (8-23 aminosav) (szigorú méretbeli kötöttség!) APC által történő bemutatás szükséges! (MHC molekulákon) glikolipidek, lipopeptidek - MHC szerű CD1 molekulák segítségével mutatja be az APC. A T sejtek néhány százaléka ismer fel ilyen antigéneket. APC – antigén prezentáló sejt

12 A KOMPLEX ANTIGÉNEK ELVI FELÉPÍTÉSE
Antigén determináns (avagy epitop) az antigén azon része, amelyet egy adott immunglobulin (B-sejt receptor, ill. ellenanyag), vagy T-sejt receptor felismerni képes Hordozó az immunglobulinnal vagy T-sejt receptorral közvetlenül nem reagáló rész (immunizálással, vakcinákkal kapcsolatban kerül elő ez a fogalom) A hordozó fogalma vakcináció és a haptének kapcsán nyeri el igazán az értelmét. Ezek a fogalmak csak az antigén és egy adott immunglobulin vagy T-sejt receptor viszonylatában értelmezhetők!

13 Antigén Epitop és „hordozó” Ellenanyag 1. Ellenanyag 2. (animált ábra)

14 AZ ANTIGÉN DETERMINÁNSOK TÍPUSAI
lineáris determináns konformációs determináns (TCR, BCR, Ig) (BCR, Ig) konformációs determinánsok Ab2 Ab1 sejtfelszíni/hozzáférhető determináns hasítás Ig – immunoglobulin, ellenanyag A lineáris determináns elég megtévesztő elnevezés – itt is a konformáció a lényeg! Neoantigén létrejöhet az antigén hasításával, vagy gyakran reaktív molekulák kémiai kötődésével is (reaktív haptének, fém ionok). Neoantigén, neoantigén determináns – valamilyen komolyabb fizikai kémiai behatás során jön létre. Irreverzibilis a változás! A rejtett/feltárt determinánsok reverzibilis módon jöhetnek létre, (ami gyakran denaturáció, hőkezezelés, detergensek hatására jön létre) és a kezelés „elmúlásával” újra el is tűnhetnek. denaturáció rejtett/feltárt determináns új/neoantigén determináns konformációs/lineáris determinánsok WB  SDS hatására eltűnhet a konformációs determinánsok egy része, de előkerülhetnek rejtett determinánsok

15 antigén prezentáló sejt (APC)
(animált ábra) Az antigén bemutatás vázlatos folyamata (lineáris neoepitopok tipikus példája) CD8+ Citotoxikus T sejt CD4+ Helper T sejt Exogén fehérjék MHC I MHC II antigén prezentáló sejt (APC) A T sejt epitopok jó példák a lineáris epitopokra – a peptid elnyújtott, linearizált formában ül az MHC molekula kötőárkában A peptidek az antigén prezentáló sejtben képződnek enzimatikus hasításokkal az antigénből – jó példák a neoepitopokra Endogén fehérjék Az MHC molekulák chaperonnak tekinthetők, amik az antigénből származó (konformáció nélküli) peptid fragmentumot elnyújtott, stabilizált, bemutatható állapotban tartják a prezentáló sejt felszínén.

16 Epitop térképezés (Epitop mapping)
fehérje antigén (aminosavlánc) PepScan: Az antigénből származó peptideket (amik lehetnek egymással átfedő szekvenciájúak is) microarray-szerűségre viszik, és ezt reagáltatják a a tesztelendő ellenanyaggal. Konformációs epitopok esetében nem hatékony. T sejt epitopok esetében megfelelő antigén prezentáló sejtekhez adják a különböző peptideket, és figyelik mely peptidek esetében történik meg a T sejtek aktivációja. peptidek Ala-Scan: Ha már ismert melyik peptidre specifikus az ellenanyag/T sejt, a peptid szekvenciában meghatározhatók a konkrét kontaktusokat kialakító aminosavak. Peptidszintézissel kisebb peptidkönyvtárak hozhatók létre. Az aminosavakat egyesével módszeresen eltérő egyszerű aminosavra pl. alaninra cserélik, és figyelik hogy történik-e változás az ellenanyag kötődésben/T sejt aktivációban. V L G T R N I P S A L G T R N I P S V stb. Az Ala-scan módszerhez peptidszintézisre van szükség. Genetikai/biotechnológiai módszerekkel peptidszintézis nélkül is lehet: Site directed mutagenesis - a mutációt a PCR primerekbe teszik, PCR reakciókkal sokszorozzák fel, majd megfelelő gazda szervezetet transzfektálnak vele, és így juthatnak megváltoztatott fehérjékhez. (pl. whole plasmid site directed mutagenesis esetén nincs is szükség rá, hogy megfelelő restrikciós helyek álljanak rendelkezésre a génszakaszok szabásvarrásához, csak megfelelően módosított anneálódó primer) Fág diszpléy könyvtárban a fág (pl. M13) burokfehérjéjét kódoló részbe illesztik bele a számunkra érdekes szakaszt. Az ellenanyag kiválasztja a neki legjobban megfelelő fágot – és ezzel kinyerhető a megfelelő szekvencia is. De még érdekesebb a fordított helyzet, amikor különféle antigén kötő ellenanyag szakaszokat illesztenek bele. Az a fág amelyik megköti az antigént, az hordozza az antigén felismerő ellenanyagnak megfelelő génszakaszt. T sejt epitopok így hatékonyabban térképezhetők, mert lineáris epitopok. Konformációs epitopoknál a módszerek egy része nem alkalmazható. Genetikai módszerek: Site directed mutagenesis Phage display library

17 Az LPS antigén vagy PAMP/DAMP?
ha antigénreceptor v. ellenanyag ismeri fel PAMP ha mintázat felismerő receptor ismeri fel TLR4 TLR4 Az LPS molekula egy glükózamin epitopját specifikusan felismerő ellenanyag LPS LPS MD2 MD2 Fc LPS Fab Fab LPS – lipopoliszaharid, gram negatív baktériumok PAMP-ja MD2 TLR4 LPS LPS TLR4 MD2

18 ANTIGÉN FELISMERÉS ≠ SEJT AKTIVÁLÁS

19 (animált ábra) A B sejtek antigén általi aktivációja hatékony módon szinte csak segítő T sejtek jelenlétében lehetséges Mindkét sejt aktivációjával jár antigén CD40L A B sejtek által felismert antigének java része nem képes a B sejtek kellő aktiválására. Th sejtek segítsége szükséges az aktivációjukhoz, nélkülük nincs pl. izotípusváltás, memória sem. Az egyszerű bakteriális poliszaharid vakcinák nem képesek hosszútávú immunitást kialakítani. CD40 citokinek B sejt aktiváció, izotípus váltás, memória sejtek kialakulása De vannak olyan antigének amik nem prezentálódnak

20 A B SEJTEK AKTIVÁLÁSA A T SEJTEK KÖZREMŰKÖDÉSE NÉLKÜL – „Tímusz independens antigének”
T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-1 T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-2 B SEJT Az antigén különböző részei a BCR-hez és más sejtfelszíni receptorokhoz (pl. LPS-kötő receptor /CD14) egyidejűleg kötődnek BCR – B sejt receptor LPS - lipopoliszaharid Sűrűn elhelyezkedő, ismétlődő, azonos epitópok (pl. szénhidrát komponensek a mikroorganizmusok falában) BCR keresztkötéseket hoznak létre B SEJT AKTIVÁCIÓ további aktivációs szignált biztosít az antigén receptor mellett extenzív receptor keresztkötés/aggregáció jön létre

21 1. Gyakorlati példa a TI antigének megváltoztatására Glu  Gly toxin
(animált ábra) 1. Gyakorlati példa a TI antigének megváltoztatására Prevenar - pneumokokkusz vakcina Baktériumok elleni immunizálásnál problémát jelent, hogy a domináns immunogén epitopok főleg bakteriális poliszaharidok. Ezek hiába könnyen előállíthatóak (tisztíthatóak) nem prezentálódnak, ezért nem aktiválnak T sejteket, így nem jön létre pl. memória B sejt válasz, ami a hosszútávú védettséget biztosítaná. Ezért sok poliszaharid vakcinában a cukorláncokat valamilyen immunogén fehérje hordozóhoz konjugálják, hogy T sejt dependens választ tudjon kiváltani. Egy ilyen célra használt fehérje a CRM197  módosított diftéria toxin (toxoid) (az eredeti fehérje egy aminosavát kicserélték (Glu  Gly) ami így nem toxikus) A toxoid megőrzi az immunogenitását és önmagában is képes lehet toxin ellenes neutralizáló antitestek termelésének indukciójára. toxin Glu  Gly toxoid diftéria toxin – szekretált exotoxin, megkötődik a sejteken, bejut és a sejten belül gátolja a protein szintézist pneumokokkuszból származó poliszaharidok

22 toxoidból származó peptid
(animált ábra) 2. A pneumokokkusz poliszaharid epitopokat felismerő B sejtek képesek a hordozó fehérje peptidjeit prezentálni a T sejteknek: toxoidból származó peptid toxoid poliszaharid MHCII TCR BCR segítő T sejt B sejt BCR – B sejt receptor TCR – T sejt receptor A toxin specifikus T sejtek, amik képesek a B sejtek segítésére létrejöhetnek DC-k segítségével is. A jó hordozó fehérjéjékre sok poliszaharid ráköthető – repetitív epitopok, hatékonyabb aktiváció (TI-2 antigénhez hasonló hatás) A komplex vakcina poliszaharidjait felismerő B sejtek bekebezik azt, és a toxoid fehérje peptidjeit képesek prezentálni MHC molekulákon. Ha ezt egy T sejt felismeri, akkor a poliszaharid specifikus ellenanyagot termelő B sejt kellő stimulációt kap, hogy memória B sejt válhasson belőle, de képes lesz akár izotípus váltásra, és affinitás érésre is. (TD) Eredményként létrejöhetnek: pneumokokkusz poliszaharid specifikus (memória) B sejtek, diftéria toxin specifikus (memória) B sejtek, diftéria toxin peptid specifikus T sejtek (esetleg a hordozóra és poliszaharid közös konformációs determinánsára együtt specifikus B sejtek is – haszontalanok, mert ilyen nem létezik a fertőzésekkor) (SLE vonatkozás: gyakran nagy fertőzések után jelenik meg bakteriális DNS-fehérje komplexek  anti-DNS ellenanyagok) citokinek, CD40-CD40L poliszaharidot felismerő memória B sejtek ( ellenanyag termelő effektor sejtek) baktériumot (bakteriális poliszaharidot) felismnerő hosszú távú ellenanyag termelés

23 Glikolipidek, lipopeptidek CD1 molekulák segítségével prezentálódhatnak speciális T sejtek számára 1. példák a professzionális APC CD1d molekulái által bemutatott mikrobiális és saját eredetű lipoidokra APC – antigén prezentáló sejt G. Bricard and S. A. Porcelli: Cell. Mol. Life Sci. Vol. 64, 2007

24 Glikolipidek, lipopeptidek CD1 molekulák segítségével prezentálódhatnak speciális T sejtek számára 2. A CD1 molekula az MHC I molekulához hasonló. A molekula kötőhelyébe a lipoid apoláros szénhidrogén lánca kötődik. A kilógó polárosabb „feji” rész (szénhidrát, peptid, szulfatid) látható a T sejtek számára Dirk M Zajonc et al.: NATURE IMMUNOLOGY VOLUME 4 NUMBER 8 AUGUST 2003

25 Glikolipidek, lipopeptidek CD1 molekulák segítségével prezentálódhatnak speciális T sejtek számára 3. Habár a CD1 molekulák az MHC I molekulához hasonlóak, exogén eredetű lipoidok bemutatására is képesek. Dirk M Zajonc et al.: NATURE IMMUNOLOGY VOLUME 4 NUMBER 8 AUGUST 2003 A professzionális fagocita antigén prezentáló sejtek (APC) egy része CD1 molekulái segítségével képes bakteriális glikolipid, lipopeptid antigének hatékony prezentációjára is. A fagocita sejteket fertőzni képes mikobaktériumok elleni immunválsz fontos eszközei.

26 + ‒ HAPTÉNEK Kis méretű molekulák, amelyek önmagukban nem képesek
immunválaszt indukálni immunválasz ‒ haptén (pl. DNP: dinitrofenil) A „hordozó” fogalma itt igazi jelentést nyer. + hordozó + haptén Nem kellően immunogén anyagok immunogenitása is növelhető azok hordozóhoz kötésével. Ilyen történhet egyes gyógyszerekel, reaktív vegyületekkel is – pl. gyógyszerérzékenység (penicillin – vörösvérsejtek felszínéhez kötődhet)

27 (animált ábra) A hordozó immunogenitást fokozó hatása a limfocita aktiváció sajátságaival magyarázható szabad haptén hordozóhoz kötött haptének Az antigén receptorokhoz asszociált Src típusú protein kinázok aktivációjának első lépése „auto”foszforiláció. Ehhez a receptoroknak egymás közelébe kell kerülniük (antigén általi keresztkötés/aggregáció) A szabad haptén egyetlen epitoppal rendelkezik és nem tud másik receptort „keresztkötni”.

28 A HORDOZÓHOZ KÖTÖTT HAPTÉNEK ELLEN IRÁNYULÓ ELLENANYAGOK TÍPUSAI
hordozó+haptén ellenanyag/antitest hordozó specifikus haptén specifikus hordozó+haptén specifikus (konformációs epitop)

29 Hagyományos antigén prezentáció MHC+peptid komplex
SZUPERANTIGÉNEK Mikrobiális fehérjék. Immunválasz elkerülő mechanizmusok egyik fajtája. Antigén prezentáló sejt (APC) jelenlétében sokféle Vβ típusú T sejt receptort (TCR) hordozó T-sejthez tudnak kötődni. Poliklonális aktiválást eredményeznek. A kötődés nem függ a TCR antigén specificitásától. A szuperantigén az MHC molekulán és a TCR-on nem a peptidkötő helyre kötődik, hanem „kívülről” kapcsolja össze az MHC molekulát a TCR-ral Hagyományos antigén prezentáció MHC+peptid komplex TCR – T cell receptor Sokféle citokin termelődik nagy mennyiségban (TNFa – toxikus sokk), IL-4 és IL-10 – leregulálja az MHC és az IFNg expressziót sok sejttípuson - fokozza a későbbi „immunszuppresszált” állapotot Vbéta típusok – T sejt receptor génszintű átrendeződésénél a variabilis domének V-J vagy V-D-J régiók egymás mellé rendeződéséből jönnek létre. A létrejött TCR-ok küzül az endotoxin többféle V régióval rendelkező TCR-rel is képes lehet kapcsolódni, de vannak amikkel nem – ezért nem képes minden T sejtet aktiválni Az ilyen módon aktivált T sejtek anergiásakká válnak vagy aktiváció indukált sejthalál áldozatai lesznek

30 Szuperantigének Konvencionális Antigén Szuperantigén 1:4 - 1:10
Fehérjék, melyek több – megfelelő TCR-t hordozó – T-sejthez tudnak kötődni és aktiválják azokat. Konvencionális Antigén Szuperantigén A szuperantigén stimulált sejtek sokféle citokint termelnek nagy mennyiségben. TNF-alfa – toxikus sokk szindrómáért felelős – szisztémás gyulladási reakció, keringés összeomlás, multiorgan failure IL-4 és IL-10 is nagy mennyiségben termelődik (Th2 sejtek) – MHC molekulák leregulálódik a sejtek jelentős részén. A túlélő Th1 sejtek és az IFNgamma függő citotoxikus sejtek működése gátlódikk az IL4 és IL10 jelenlétében. Poliklonális T sejt válasz és aktiváció indukált sejtpusztulás vagy anergia 1:4 - 1:10 aktiválódó sejtek aránya Monoklonális/Oligoklonális T sejt válasz  klonális osztódás 1: :105 aktiválódó sejtek aránya

31 B sejt szuperantigének A szuperantigéneket gyakran csak a T sejtekkel hozzák összefüggésbe, pedig hasonló hatású B sejt szuperantigének is Az ellenanyag molekuláknak nem az antigén kötő részéhez hanem valamely más részéhez kötődnek. (pl. Fc rész) Kötődésük független az ellenanyag molekula specificitásától A szuperantigénhez kötött ellenanyag nem képes effektor funkciókat aktiválni. Képes lehet a B sejtek poliklonális aktiválására (pl. SpA).

32 SZUPERANTIGÉNEK Osztályozás Forrás Endogén Exogén (T sejt) B sejt
Exogén (T sejt) B sejt 1.Mouse mammary tomor virus (MMTV) (retrovírus, integrálódik a genomba  endogén) Epstein-Barr virus asszociált szuperantigén (EBV) (az EBV egyik fehérjéje egy valódi endogén retrovírális szuperantigént reaktivál)(HERV-K18, ERKV-18) Staphylococcal enterotoxins (SEs): A, B, C1 to C3, D, E, G to Q Staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) Staphylococcal exfoliative toxins: exoliatin A, exfoliatin B Staphylococcal enterotoxin-like toxins formed due to recombination within enterotoxin gene cluster: U2, V Streptococcal pyrogenic exotoxins (SPEs): A1 to A4, C, G to M Streptococcal mitogenic exotoxins: SMEZ Streptococcal superantigen :SSA Yersinia pseudotuberculosis: Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen (YAM) Mycoplasma species: Mycoplasma arthritidis-derived mitogen (MAM) Cholera toxin:  subunit A of cholera toxin Prevotella intermedia* Mycobacterium tuberculosis* Viral superantigens:  (a) Mouse leukemia virus                                         (b) IDDMK1222- Ppol-ENV-U3                                         (c) HIV-Nef                                         (d) Rabies virus-nucleoside protein Staphylococcal protein A Protein G Protein Fv (PFv) The superantigens can be broadly classified into following families: Endogenous superantigens: These superantigens are encoded by various viruses integrated into the genome. Examples are superantigens produced by mouse mammary tumor virus (MMTV). Mouse mammary tumor virus (MMTV) - retrovirus. It is integrating in the genome --> "endogenous" viral superantigen (MMTV encoded). Epstein-Barr virus (EBV) associated superantigen. The EBV LMP2A protein takes part in the reactivation of a real endogenous (former retroviral) superantigen: Human Endogenous Retrovirus Superantigen HERV-K18 (or ERVK-18) ii. Exogenous superantigens: These include the exotoxins secreted by microorganisms. Examples are staphylococcal enterotoxins (A, B, C1 to C3, etc.), streptococcal pyrogenic exotoxins (A1 to A4, C, etc) and others iii. B-cell superantigens: Those superantigens which stimulate predominantly B cells. Examples include staphylococcal protein A and protein Fv.

33 Az immunglobulinok (Ig) szerkezete és funkciói

34 Immunoglobulinok (glikoproteinek)
Mobilitás alapján gamma-globulin Immunológiai funkció alapján antigén-specifikus fehérjék B sejt membránban antigén felismerő receptor BCR – B sejt receptor Testfolyadékokban (pl. szérum) ellenanyagok, antitestek A gamma globulin frakció jelentős része IgG (azaz gamma izotípusú immunglobulin), de a többi izotípust is itt lehet megtalálni. Szérum összetevőkről majd a szerológiai reakcióknál (precipitáció, agglutináció) lesz említés, látványos ábrákkal. Ha a gamma globulin frakció növekedett és keskeny csúcs szerűséget mutat, az utalhat monoklonális ellenanyag termelő sejtek jelenlétére (mielóma) Az ábrán látható mértékű gamma globulin frakció emelkedés komoly fertőzéskor vagy kísérleti állat „hiperimmunizációja” során jelenhet meg

35 Az immunoglobulin szerkezete
Könnyű és nehéz láncok Diszulfid hidak láncok közötti láncon belüli diszulfid híd (-S-S-) NH2 szénhidrát Variabilis és konstans részek Kapocs régió COOH CL VL kapocs régió Domének VL & CL VH & CH1 - CH (CH4 pl. IgM) Oligoszaharid lánc poszttranszlációs módosításként kerülhet szénhidrát, oligoszaharid a nehézlánc egyes konstans doménjeire – izotípus függő. Több helyen is lehet – lásd később a táblázatokat CH2 CH3 CH1 VH IgG ~ kDa (eltérő glikoziláltság)

36 Immunoglobulin (szerű) domén:
~12kDa

37 Ribbon structure of IgG
hinge - kapocs

38 A kapocs régió segíti az ellenanyag alkalmazkodását az antigén felszínén jelenlevő epitopokhoz

39 ELLENANYAGOK IZOTÍPUSAINAK SZERKEZETI JELLEMZÉSE

40 Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések feltárása
Papain Fab (Fragment antigen binding) Ag kötés (valencia=1 monovalens) Specificitást a VH és a VL domének határozzák meg VH VL Fc – kristályosítható fragmentum (konstans, homogén) Fab – antigén kötő (Ag binding) fragmentum Az Fab fragmentumok önmagukban nem voltak képesek bizonyos funkciókra  Fc fragmentum valószínűleg szükséges hozzá Fc (Fragment crystallizable) Fc Fab

41 Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések
Pepszin F(ab’)2 Antigén kötés bivalens! valencia=2 bivalens – képes lehet precipitációra, agglutinációra képes lehet tirozin kináz receptorok ativálására (keresztkötés  foszforiláció) A papainos hasítással létrehozott monovalens Fab fragmentum viszont hatékony lehet az ilyen receptorok gátlásában Fc peptidek + F(ab’)2 Az effektor funkciók egy részét Fc régió hiányában továbbra sem képes indukálni, de képes lehet pl. agglutinációra/precipitációra (lásd következő szeminárium)

42 Az immunglobulinok enzimes hasítása segített a szerkezet és funkció sajátságainak vizsgálatában
antigén- kötés kötődés az Fc receptorokhoz komplement kötés placentális transzfer

43 Miért szükséges az Fc régió?
felismerni az antigént precipitálni az antigént (bivalencia!) blokkolni a toxinok vagy patogénnel asszociált molekulák aktív helyét (neutralizáció) blokkolni a gazdasejt és a patogénnek molekulái közötti kölcsönhatásokat (neutralizáció) az F(ab’)2 fragmentum képes sejtekkel kapcsolatos gyulladásos és effektor funkciókat a komplement rendszer gyulladásos és effektor funkcióit fagocitózist és az azt követő antigén prezentációs folyamatokat de Fc régió hiányában nem képes aktiválni

44 Ellenanyagok típusaival kapcsolatos fogalmak
OSZTÁLY/ALOSZTÁLY ANTIGÉNKÖTŐ HELY A H-lánc (nehézlánc) konstans régiójának típusai, eltérő aminosav szekvencia Ig osztályok: IgG, IgA, IgE, IgD, IgM; alosztályok: IgA1-2, IgG1-4 (könnyűlánc izotípusok: κ, λ) A konstans szekvenciákban található allélikus változatok IgG – „Gm allélek” bizonyos betegségekkel kapcsolatba hozhatóak A H- és L-lánc variábilis (V) régióinak egyedi szekvencia variabilitása (klón-specifikus) Az antigén kötő tulajdonságra, az antigén specificitást biztosító molekularészre utal Létrehozhatóak a típusokat felismerő ellenanyagok: anti-izotípus ellenanyagok (pl. anti-IgG) idiotípusokat felismerő, megkülönböztetésre (tipizálásra) használható ellenanyagok anti-idiotípus ellenanyagok – kompetitálhat az antigénnel az antigén specifikus ellenanyagért – segítségével leválasztható az ellenanyagról a megkötött antigén Gm allotípusok kapcsolatban lehetnek egyes betegségekkel – pl. szklerózis multiplexszel Clin Immunol Immunopathol Nov;37(2): IgG (Gm) allotypes and multiple sclerosis in a French population: phenotype distribution and quantitative abnormalities in CSF with respect to sex, disease severity, and presence of intrathecal antibodies. Sesboüé R, Daveau M, Degos JD, Martin-Mondiere C, Goust JM, Schuller E, Rivat-Peran L, Coquerel A, Dujardin M, Salier JP. Egy B sejt egyféle specificitású idiotípusú elenanyagot termel. Ez igaz a B sejtes tumorokra is (B sejt limfóma) Limfómák terápiája (limfóma sejtek elpusztítása) anti-idiotípus ellenanyagokkal: Proc Natl Acad Sci U S A Jul 22;105(29): Epub 2008 Jul 21. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: safety and immunogenicity in a phase I clinical study. McCormick AA, Reddy S, Reinl SJ, Cameron TI, Czerwinkski DK, Vojdani F, Hanley KM, Garger SJ, White EL, Novak J, Barrett J, Holtz RB, Tusé D, Levy R. Plant-made vaccines have been the subject of intense interest because they can be produced economically in large scale without the use of animal-derived components. Plant-made therapeutic vaccines against challenging chronic diseases, such as cancer, have received little research attention, and no previous human clinical trials have been conducted in this vaccine category. We document the feasibility of using a plant viral expression system to produce personalized (patient-specific) recombinant idiotype vaccines against follicular B cell lymphoma and the results of administering these vaccines to lymphoma patients in a phase I safety and immunogenicity clinical trial. The system allowed rapid production and recovery of idiotypic single-chain antibodies (scFv) derived from each patient's tumor and immunization of patients with their own individual therapeutic antigen. Both low and high doses of vaccines, administered alone or co-administered with the adjuvant GM-CSF, were well tolerated with no serious adverse events. A majority (>70%) of the patients developed cellular or humoral immune responses, and 47% of the patients developed antigen-specific responses. Because 15 of 16 vaccines were glycosylated in plants, this study also shows that variation in patterns of antigen glycosylation do not impair the immunogenicity or affect the safety of the vaccines. Collectively, these findings support the conclusion that plant-produced idiotype vaccines are feasible to produce, safe to administer, and a viable option for idiotype-specific immune therapy in follicular lymphoma patients. Heterogén populációban az egyedek közötti természetesen jelen levő különféle változatok Egyeden, vagy akár a többi típuson belül különféle antigéneket felismerő változatok Egyeden belüli (eltérő funkciójú) típusok

45 Humán Immunglobulin Osztályok
IgG - gamma () nehézláncok IgM - mü () nehézláncok IgA - alfa () nehézláncok IgD - delta () nehézláncok IgE - epszilon () nehézláncok Izotípusok! könnyűlánc típusok kappa () lambda ()

46 A izotípusok között szerkezeti és funkcionális különbségek vannak
(pl. CH domének száma) Eltérnek az izotípusok a CH domének számában is vagy hexamer

47 Az ellenanyagok valenciája (kötésszáma)
2 Szabad IgM pentamer (”csillag”) 2 2 4 Antigénhez kötött IgM (”rák”) 10 vagy 12

48 affinitás – fizikai kémiailag jól jellemezhető, számolható fogalom
aviditás – több kötés együttes jelenléte miatt nem azonos az affinitással, nehezen számítható (nem összeadódnak az affinitások – egy bivalens kölcsönhatás sokszor erősebb lehet egy monovalensnél)

49 ELLENANYAGTERMELÉS és IZOTÍPUSOK
A PRIMER ÉS SZEKUNDER IMMUNVÁLASZ SORÁN növekvő szérum ellenanyag titer hetek X-antigén első X-ellenes válasz második X-ellenes alacsony magas antigénfüggő x erősebb az első válasznál Az antigénnel való találkozás után az ellenanyagok megjelenéséig eltelő idő Az antigénnel való találkozás és a válasz csúcspontja között eltelt idő Az ellenanyagtermelés mértéke A termelt izotípusok Ellenanyag affinitás B-sejt típus Tulajdonság Elsődleges immunválasz Másodlagos immunválasz primer – elsődleges szekunder – másodlagos (tercier nincs, mert gyakorlatilag a szekunderrel azonos minden további immunizálás)

50 Miért pentamer/hexamer a szolubilis IgM molekula?
Izotípusok megjelenése a primer és szekunder immunválasz során ellenanyagszint szekunder válasz az A antigénnel szemben primer válasz az A antigénnel szemben primer válasz a B antigénnel szemben napok Miért pentamer/hexamer a szolubilis IgM molekula?

51 Az antigén determináns és az ellenenyag antigénkötő ”zsebe” közötti kölcsönhatás modellje
A kapcsolatok kialakításáért a leginkább a variábilis régión belüli hivervariabilis részek felelősek Egyszerű modell, hogyan lehet elképzelni az antigén kötőhelyet (kötőfelszínt)

52 (a különböző aminosavak száma)
Complementary Determining Region (CDR) aminosav pozíció az Ig-lánc V régiójának szekvenciájában (a különböző aminosavak száma) Variábilitás 3 CDR régió 1 V doménen

53 AZ ELLENANYAGOK EFFEKTOR FUNKCIÓI
Kétféle fő funkciót lehet megkülönböztetni: neutralizáció antigén kijelölése az effektor mechanizmusok számára (sokféle effektor mechanizmus)

54 Az ellenanyagok effektor funkciói

55 Az ellenanyagok effektor funkciói
Későbbi szeminárium

56 NEUTRALIZÁCIÓ az antigén kötéssel direkt módon összefüggő funkció ( Fab is képes rá) A sejtek károsodnak/fertőződnek A neutralizáló ellenanyag a patogénen levő molekulához vagy toxinhoz kötve meggátolja annak kötődését a célsejten lévő célmolekulához (receptorhoz) A sejteket megvédik a patogént/toxint neutralizáló ellenanyagok Immunizálás során a szervezetben létrejött, vagy a passzív immunizálás során bejuttatott ellenanyagok így védenek: pl. vírusfertőzésk ellen, vagy toxinok hatását blokkolhatják, vagy baktériumok adhézióját gátolhatják az epitélsejteken

57 Fc receptor mediált funkciók
γ  IgG kötés FcεR : ε  IgE kötés Fő FcR típusok: FcαR : α  IgA kötés Sokféle sejt rendelkezik Fc receptorokkal! FcRn „neonatális” Fc receptor Placenta, epitél sejtek, stb. IgG transzfer pIgR poli Ig receptor epitél sejtek IgA, IgM transzfer

58 OPSZONIZÁLÁS Opszonizáció nélkül a fagocitózis nagyságrendekkel kisebb hatékonysággal megy végbe

59 antitest függő celluláris citotoxicitás
Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) antitest függő celluláris citotoxicitás Az ellenanyag kötődis a sejtfelszíni antigénhez Az Fc-receptor keresztkötések aktiválják az NK sejt ölőmechanizmusait A célsejt apoptózissal elhal Az NK sejtek receptorai érzkelik a kötött ellenanyagokat nagyméretű sejt/patogén ellenanyaggal borítva Citotixikus granulumok tartalmának ürítése

60 Az előző ábrákon az ellenanyagok (több ellenanyag
Az előző ábrákon az ellenanyagok (több ellenanyag!) először hozzákapcsolódtak az antigénhez, és a kis affinitású Fc receptorok csak így voltak képesek kellően erős aviditással hozzákötni az antigén-antitest komplexhez. A nagy affinitású Fc epszilon receptor képes szabad IgE molekula megkötésére is aviditás – több egyedi affinitás összesített kötési ereje, ami nem azonos azok összegével, mert mértéke nagyságrendileg meghaladhatja az egyes affinitások összegét A korábbi táblázat szerint a nagy affinitású FCgRI (CD64) is képes ilyenre, pedig egy nagyságrenddel kisebb az affinitása, mint az FceRI esetében

61 FcεR általi HÍZÓSEJT DEGRANULÁCIÓ KIVÁLTÁSA
antigén specifikus IgE ellenanyagokkal Az FcεR-ok keresztkötése a specifikus IgE molekulákhoz kapcsolódó patogénen/allergénen keresztül antigén specifikus IgE ellenanyaggal „felfegyverzett / szenzitizált” hízósejt degranuláció Az IgE szabad állapotban is képes kötődni a nagy affinitású FcεR receptorhoz. A sejt ilyen állapotban várja a találkozást az antigénnel patogén eliminálása (allergiás tünetek)

62 A különféle izotípusok jellegzetes eloszlást mutatnak a szervezetben
ELLENANYAG IZOTÍPUSOK KAPCSOLATA AZ EFFEKTOR FUNKCIÓKKAL IgG Az izotípusok eloszlásáért többek közt „szállító” Fc receptorok felelősek A kék-rózsaszín szív nem magára a szervre, hanem a vérkeringésben levő IgG és IgM típusok dominanciájára utal. A különféle izotípusok jellegzetes eloszlást mutatnak a szervezetben

63 és szállító Fc receptorok
FcRn „neonatális” Fc receptor Placenta, endotél, epittél sejtek, stb. IgG transzfer, IgG megőrzés pIgR poli Ig receptor epitél sejtek IgA, IgM transzfer

64 pIgR: A SZEKRETOROS IgA TRANSZPORTJA
A pIgR elhasítása teszi lehetővé az IgA leválását, ami a továbbiak során ezt a receptor darabot mint „szekretoros fragmentumot” hordozza J C S s J C S s J C S s MUC I N J C S s J C S s Az IgA és pIgR transzcitózissal vezikulákban átkerül az apikális felszínre J C S s Epithel sejt Az IgA a bélrendszer és légzőrendszer epiteliális felszíneire szállítódik ki, és megjelenik a szekrétumokban is (nyál, tejtermelő mirigyek) IgA és IgM ilyen módon kerül ki az anyatejbe A pIgR és az IgA internalizációja A “poli Ig receptorok” (pIgR) az epithel sejtek bazolaterális felszínén találhatóak. Az itt található IgA (és IgM) ellenanyagokat szállítják az apikális felszínre J C S s B A szubmukóza B-sejtjei (BALT, GALT) dimer IgA-t termelnek

65 Mit szállít a pIgR? Hova szállít?
J lánccal rendelkező (polimer) izotípusokat: IgA, IgM (ez a J lánc nem összekeverendő a VJ/VDJ átrendeződés J régiójával!!!) Hova szállít? bél- és légzőrendszeri felszínek, szekrétumok (nyál, anyatej)

66 Az IgG placentális transzportja: A neonatális Fcg receptor (FcRn)
Humán FcgRn Humán MHC Class I A placenta sejtek felveszik az anyai ellenanyagokat az anyai keringésből. Az endoszóma savas közegében az FcgRn megköti az ellenanyagokat (IgG specifikus), átszállítja a fötális oldalra, és az ott levő neutrálisabb pH hatására elengedi azokat. Egyes állatok esetében ez az előtejjel történik meg: Az újszülött bélrendszerében az FcγRn megköti a kolosztrumból származó anyai eredetü IgG-t (pH6.5). A receptor ezután transzcitózissal átszállítódik az epitéliumon és a megváltozott kémhatás hatására (pH 7.4) az IgG felszabadul és bekerül az újszülött állat keringésébe (további transzporttal) (érdekesség- Az FcgRn és az MHC I molekula szerkezeti rokonságban áll.) Hasonló receptorok vannak az endotél sejtekben is. A pinocitózissal felvett ellenanyagokat ezek megkötik és visszaszállítják a felszínre – megmentik a lizoszómális lebontástól – növeli az ellenanyagok féléletidejét. Egérben nincs ilyen receptor, de bele lehet tenni – az ilyen egerekből sokkal több ellenanyag nyerhető ki (pl. diagnosztikai vagy kísérletes célokra) (Az FcRn és az MHC I molekula szerkezeti rokonságban áll)

67 FcRn, FcγRn (neonatalis Fc receptor)
IgG és albumin szállítására képes. Újszülött rágcsálók bélrendszerében 100x magasabb az expressziója mint más szöveteken illetve az egyedfejlődés későbbi szakaszában. Náluk nincs placentális transzfer, hanem az anyatejből (illetve a colostrumból) szerzi be a szervezetük az IgG-t. Rágcsálóknál az anyatejbe is ilyen receptorral kerülhet ki az anyai keringésből az IgG, főleg a laktáció elején (colostrum, fröccs tej). Azért közvetlenül a szülés után van, mert olyankor még nincsenek enzimek az újszülött rágcsáló bélrendszerében. Később nagyobb eséllyel emésztődik meg az IgG, mielőtt felvételre kerülne. Különféle sejttípusokban van jelen: endothel sejtek epiteliális sejtek (emésztő és légutak) újszülött rágcsálók bélrendszerében 100x magasabb az expressziója mint az egyedfejlődés későbbi szakaszában immunrendszer sok sejttípusa, professzionális APC-k

68 Ha az epitélsejt másik oldalán távozik: transzcitózis
FcRn működése pinocitózis savas közegben nagy affinitással köti az IgG-t, és megmenekíti a lizoszómális lebomlástól Az urogenitális traktusban, a rektumban és a felső légutak egy részében több az IgG, mint az IgA The Immunologic Functions of the Neonatal Fc Receptor for IgG J Clin Immunol (2013) 33 (Suppl 1):S9–S17; DOI /s y Dendritikus sejtek cross-prezentációs folyamatában is lényeges szerepe van  Ag-Ab komplexek megmentése a lizoszómális lebontástól…… A rendszeres IVIG és friss fagyasztott szérum azért lehet hatékony egyes type II hiperszenzitivitásokban, mert a bejuttatott nagy mennyiségű IgG telíti az FcRn rendszert, és a „felesleges” nagy mennyiségű IgG ellenanyag az autoellenanyagokat is beleértve hamarabb lebomlik (kihígul) Ha az epitélsejt másik oldalán távozik: transzcitózis Az IgG a szervezet leg különfélébb helyeire kerülhet el a keringésből ilyen módon: vérkeringés  szövetek szövetek  epiteliális felszinek (az urogenitális traktusban, a rektumban és a felső légutak egy részében több az IgG, mint az IgA) anyai keringés  magzati keringés

69 Az FcRn miatt az IgG szérum féléletideje kiugróan magas
Az albumint is hasonlóan védi meg FcγRn túlexpresszáló transzgenikus állatokban nagy mennyiségű poliklonális IgG ellenanyagot termeltethetünk

70 FcγRIIB mediált B sejt feedback reguláció
Ag Ag B sejt FcγRIIb B sejt FcγRIIb Az FcγRII receptoron foszforilálódó ITIM motívumok foszfatázokat toboroznak a jelátviteli utakba. Gátolják az antigén receptor szignálját.

71 Nehéz láncú ellenanyag (hevy chain Ig, hcIg)
VHH fragment nanobody vagy sdAb antigén (lizozim) IgG: ember, egér, patkány hcIgG: tevefélék (Camelidae) teve, dromedár, láma immunoglobulin new antigen receptor (IgNAR): porcos halak, cápák Cápáknak vannak hagyományos ellenanyagai is (nehéz és könnyűláncú): IgM, IgW(IgD-hez hasonló) J Immunol Sep 15;191(6): doi: /jimmunol Epub 2013 Aug 9. Shark IgW C region diversification through RNA processing and isotype switching. Zhang C1, Du Pasquier L, Hsu E.

72 MONOKLONÁLIS ELLENANYAGOK POLIKLONÁLIS ELLENANYAGOK

73 A TERMÉSZETES ELLENANYAG VÁLASZ POLIKLONÁLIS
Poliklonális ellenanyag Immunszérum B-sejt készlet Ag Ag Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok (Több klón termékei, különféle epitopokat ismerhetnek fel)

74 Monoklonális ellenanyagok előállítása
Antigén specifikus poliklonális ellenanyagokhoz legegyszerűbben immunizált élőlények szérumából juthatunk. Hosszú távon újabb és újabb immunizálást igényel. - Nehezen standardizálható - Limitált mennyiségben áll rendelkezésre - Gondok lehetnek a specificitással is: ? ? ? Ha fel tudnánk szaporítani valamelyik B sejtet, ami „felismeri” az antigént, sokkal egyszerűbb volna a helyzet. Monoklonális ellenanyagok előállítása

75 Monoklonális ellenanyagok
(animált ábra) Antigén Monoklonális ellenanyagok Poliklonális ellenanyagok

76 Monoklonális ellenanyagok
egyetlen B-limfocita klón termékei homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus) előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben állíthatók elő osztódóképes – tenyészthető, egyféle ellenanyag termelő sejteket kellene előállítani - „in vivo” patológiás körülmények között is előfordulhat pl. mieloma multiplex esetében egy B sejt klón malignus szaporulata miatt nagy mennyiségű monoklonális ellenanyag lehet jelen („gammopátia” – rendelleneség a gamma globulin szérum frakcióban)

77 Myeloma multiplex A szérum elektroforézise monoklonális fehérje jelenlétét mutatja ki, amely további vizsgálattal lambda-könnyűláncú IgG-nek bizonyult. normál szérum a beteg széruma

78 Hogyan lehetne monoklonális ellenanyagot előállítani?
B sejt transzformáció/immortalizálás vírussal EBV – humán B sejteket transzformál/immortalizál - Az antigén specifikus klónok elkülönítése körülményes - A vírus ott lesz a termékben is

79 Lehetőségek? Fúzió immortális sejtvonallal
Követelmények a fúziós partnerrel szemben ne legyen saját ellenanyag termelése ne befolyásolja a B sejtek ellenanyag termelését szelektálhatóság: könnyen megszabadulhassunk a felesleges, nem ellenanyag termelő sejtektől Kevés jó fúziós partner létezik: Egér: Sp2/0-Ag14 (SP2) Humán: nincs igazán jó általános fúziós partner! heteromielómákat, triómákat használnak fúziós partnerként: (maga a fúziós partner is 2-3 sejt hibridje - gyakran egér-humán hibrid) CB-F7, K6H6B5, H7NS, NAT-30, HO-323, A4H12

80 Lehetőségek? Mikromanipuláció (műszerigényes) „FuCell”

81 A B sejtet kontaktusba hozzák a fúziós partnerrel
antigén fluoreszcens/paramágneses jelzés B sejt Előre szelektált antigén specifikus B sejttel történik (jelölt antigénnel festés) A B sejtet kontaktusba hozzák a fúziós partnerrel Elektromos tér segítségével történik a fúzió Mivel nem szükséges szelektálni, jóval többféle humán fúziós partner szóba jöhet (szinte bármely immortális sejtvonal megfelelő) A fúzió folyamata

82 Monoklonális ellenanyagok előállítása
(Több módszer is létezik. A leg elterjedtebb: egér SP2 sejtvonallal végzett sejtfúzió alapú „hibridóma” módszert tekintjük át a következőkben) Georges J.F. Koehler és Cesar Milstein (Nobel díj 1984-ben) A hibridóma technika A számunkra értékes tulajdonsággal rendelkező, de korlátozott élettartamú immunsejtet kiválasszuk, és korlátlan ideig fenntarthatóvá, szaporíthatóvá tegyük. Antigén specifikus immunsejteket fuzionáltatunk korlátlanul szaporodó tumorsejtekkel. A kapott hibridek közül számunkra azok értékesek, amelyek kromoszomálisan stabilak, rendelkeznek az adott immunsejt tulajdonságaival, és korlátlanul szaporodnak. (antigén specifikus (APC-MHC-peptid), T sejt hibridómák is létrehozhatóak) A megfelelő hibrid sejteket többlépéses szelekció végeredményeként, sejtklónok formájában kapjuk meg.

83 Monoklonális ellenanyag előállítás menete (vázlatosan)
egér/patkány beoltása antigénnel a célsejteket tartalmazó lép vagy nyirokcsomók izolálása, homogenizálása lépből származó plazmasejtek és B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/ mielóma sejtek) fúziója Az ellenanyag termelő klónok szelekciója/azonosítása (több lépésben) A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatukból kinyerhető (1.) (2.)

84 Sejtfúzió lépsejt mielómasejt (SP2) Napok alatt maguktól elpusztulnak
(animált ábra) Sejtfúzió lépsejt mielómasejt (SP2) PEG, Sendai virus, mikromanipulátor+nagyfrekvenciás elektromágneses mező Napok alatt maguktól elpusztulnak Szaporodó sejtek

85 Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny
1. fő szelekciós lépés Szaporodó sejtek lépsejt mielómasejt (SP2) HGPRT+ TK+ HGPRT- TK- Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny a normál sejtek napokon belül elpusztulnak HGPRT+ TK+ HGPRT- TK- (animált ábra)

86 Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek
2. fő szelekciós lépés: Az ellenanyag termelő sejtek kiválasztása (animált ábra) Nem antigén specifikus ellenanyagot termelő, vagy ellenanyagot nem termelő hibridek Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek Nincs jelen az antigénnel reagálni képes ellenanyag. Vannak a sejtkultúrában az antigénnel reagálni képes ellenanyagok. Eldobjuk Tovább tenyésztjük, sejtklónozzuk.

87 (ellenőrzés pl. ELISA módszerrel – lásd a későbbi gyakorlatokon)
(animált ábra) A sejtklónozás célja A kapott hibridómák összessége poliklonális ellenanyag keveréket termelne, melyek között előfordul antigénre nem specifikus is Különféle monoklonális ellenanyagokat termelő B sejt hibridóma klónok közül az antigénre specifikusakra van szükségünk (ellenőrzés pl. ELISA módszerrel – lásd a későbbi gyakorlatokon)

88 A „HAT” szelekció biokémiája
A szelektív tápfolyadék: A „HAT” szelekció biokémiája Hipoxantin, Aminopterin, Timidin tartalmú tápfolyadék nukleotid prekurzor gátlószer

89 ”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok
(animált ábra) A DNS szintézis két fő útja ”salvage” útvonal nukleinsav lebontási termékek felhasználása, purinok, hipoxantin, timin HGPRT, TK (hipoxantin guanin foszforibozil transzferáz, timidin kináz) nukleozid trifoszfátok DNS ”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok egyéb enzimek aminopterin HAT médium – Hipoxantin+Aminopterin+Timidin Az aminopterin az anyagcsere blokkoló. A hipoxantin és a timidin a salvage útvonal alapanyagai. Az SP2 mielóma sejtekben csak ez a „de novo” útvonal működőképes! (HGPRT‒, TK‒) ”de novo” útvonal

90 Technikai nehézségek:
A fúziós partner SP2 sejtvonalnak nincs saját ellenanyag termelése, és nincsenek HGPRT és TK enzimei. Ez teszi ideális fúziós partnerré! Technikai nehézségek: A transzformált sejtvonalak sajnos gyakran genetikailag instabilak. Ez a létrehozott hibridómákra is igaz. Rendszeresen ellenőrizni kell az ellenanyag termelésüket és antigénspecificitásukat – adott esetben újraszelektálni/klónozni Megtörténhet, hogy az SP2„magához tér”és aktív HGPRT és TK jelenik meg benne! Az ilyen SP2 sejtektől egy másik fajta szelekcióval szabadulhatunk meg:

91 ”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal
Hogyan hozható létre/tartható fent a HGPRT-, TK- (defficiens) fúziós partner sejtvonal? ”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal HGPRT- és TK- fúziós partner sejtek szelektálhatóak Ezek a pirimidin és purin vegyületek a HGPRT+ vagy TK+ sejtek esetében osztódáskor a ”salvage” útvonalon az örökítőanyagba épülve a sejtek pusztulásához vezetnek, élve hagyva a HGPRT- TK- sejteket.

92 A poliklonális és monoklonális ellenanyagok összehasonlítása
Poliklonális ellenanyag Kis affinitású Monoklonális Ea. Nagy affinitású Monoklonális Ea. Felismert antigén determinánsok száma több egy Specificitás (keresztreaktivitás) polispecifikus gyakran polispecifikus monospecifikus Affinitás kicsi-nagy (keverék) kicsi nagy Nem-specifikus immunglobulinok koncentrációja magas (tisztítástól függ) alacsony (0) Hozam (koncentráció) alacsony (tisztítással javítható) Előállítási költség alacsony? magas? Standardizálhatóság nem, ill. nehézkes egyszerű Mennyiség limitált korlátlan Gyakorlati felhasználhatóság módszer függő gyenge kiváló

93 Monoklonális ellenenyagok általános felhasználási lehetőségei
Immundiagnosztika (tumordiagnosztika - tumor spec mEA-gal) Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása (differenciációs, aktivációs markerek) Immunhisztokémia Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével - Sejtek elválasztása (pozitív – negatív szelekció –FACS, Panning, vasszemcsék mágneses térben) CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) Komplex antigén keverékek analizálása (Western, ELISA……) Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata / gátlása Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin lymphomában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással Kovalensen kapcsolt, liposzómába zárt toxin Gyógyszer-eliminálás antitestekkel Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

94 Passzív immunizálás VESZÉLYEZTETETT EGYED
egér monoklonális ellenanyagok Humán immunglobulin transzgenikus egér humanizált, egér monoklonális ellenanyagok (rekombináns módszerekkel) immunizálás humán monoklonális ellenanyagok VÉDETT EGYÉN szérum ellenanyag A szervezet saját B és T sejtjei (adaptív immunrendszer) nem aktiválódik. Más effektor immunsejtek igen. Az immunrendszer nem a szokásos módon aktiválódik Azonnal hat Átmeneti védelem/hatás Immunoglobulin lebomlás! VESZÉLYEZTETETT EGYED

95 Természetes passzív immunizálás:
Típus Alkalmazás Intramuszkuláris (kis mennyiségben jut be, kevésbé hatékony) HBV-Ig; Varicella-Zoster-Ig; Anti-D profilaxis Intravénás (IVIG) Humorális immundefektusok (Bruton-féle agammaglobulinaemia; hypogammaglobulinaemiával járó variábilis és kevert immundefektusok) Méreg elleni ellenanyagok (pl. kígyómarás) Természetes passzív immunizálás: Placentán átjutó IgG – újszülött védelme az első hónapokban Anyatej: IgA – emésztőrendszer és a felső légutak védelme

96 Poliklonális ellenanyagok terápiás felhasználása
mérgek elleni antiszérumok (Antivenom) kígyók, skorpiók, pókok, mérges tengeriherkentyűk mérgei elleni antiszérumok nagyméretű állatok fokozatos hiperimmunizációja (általában lovak) tisztított immunglobulin frakció kinyerése a plazmából - csökkenti az immunizálódás valószínűségét és mértékét; a többi szérumfehérje hiányában esetleg többszöri terápiás immunizálás is lehetséges

97 Monoklonális antitestek, mint beadható gyógyszerek?
Az egérben termelődő antitestek emberbe oltva -fajidegen fehérjeként - immunválaszt indukálhatnak. (ld. immunogenitást meghatározó tényezők – filogenetikai távolság!) Hogyan kerülhető meg a probléma?

98 A monoklonális antitestek evolúciója
Humán Egér / Patkány Kiméra Humanizált The participation in regulatory review allows the researcher reviewer a reality check for the real regulatory impact of the MOA data A humanizált ellenanyagok glikozilációja a termelő sejttípus (álalában egér) sajátságainak megfelelő. Létrehozhatók valódi humán monoklonális ellenanyagok humán hibridómák segítségével.

99 Gyógyszerként alkalmazott monoklonális ellenanyagok
- Tumorterápia Lehetővé tették a célzott, szelektív kemoterápia következő lépcsőfokának elérését (Sejttípus-specifikus, de még mindig nem csak a malignus sejtekre specifikus!) Immunszuppresszió Sejttípusra specifikus immunszuppresszió lehetősége

100 Monoklonális ellenanyagok a tumorterápiában
„Naked MAb”, nem konjugált antitest Anti-CD20 (rituximab – Mabthera/Rituxan, humanizált): B-sejtes Non-Hodgkin lymphoma Anti-CD52 (alemtuzumab – Mabcampath, humanizált): chronicus lymphoid leukaemia (3. vonalban, chlorambucil és fludara rezisztens esetekben) Anti-ErbB2 (trastuzumab – Herceptin, humanizált): emlőtumor Anti-VEGF (bevacizumab – Avastin, humanizált): colorectalis tu. (+ Lucentis!) Anti-EGFR (cetuximab – Erbitux, kiméra): colorectalis tu. (+ Vectibix, rekomb. humán!) 2. konjugált antitest Anti-CD20 + yttrium-90 izotóp (ibritumomab- Zevalin) Anti-CD20 + jód-131 (tositumomab – Bexxar, kiméra!)

101 Immunszuppresszív készítmények
Anti-TNF-α antitestek infliximab (Remicade): 1998 óta, kiméra adalimumab (Humira): 2002, rekombináns humán Etanercept (Enbrel) – dimer fúziós fehérje, TNF-α receptor + Ig Fc-vég (Nem monoklonális antitest, csak Ig Fc-véget tartalmaz!) Anti-TNF-α terápia indikációi: Rheumatoid arthritis Spondylitis ankylopoetica (SPA - M. Bechterew) Plakkos psoriasis, arthritis psoriatica Crohn-betegség, colitis ulcerosa (általában - még - nem 1. vonal!)

102 Terápiás monoklonális antitestek elnevezése
A gyógyszerként használt monoklonális antitesteket generikus névvel illetik. A nevezéktan sémáját a WHO határozza meg. A nevezéktan részei: Például:Abciximabab- + -ci(r)- + -xi- + -mab, egy kardiovaszkuláris megbetegedésekben használt monoklonális kiméra ellenanyag.

103 Módosított monoklonáris ellenanyagok alap típusai
A módosításokkal tovább csökkenthető a termék immunogenitása, és növelhető a funkciójának specificitása – felesleges/nem kívánatos effektor funkciókat nem indukál (viszont az IgG Fc rész hiányában gyorsabban eliminálódik a szervezetből) (papain) (pepszin)

104 Kiméra Antigén Receptor (CAR)
Effektor citotoxikus vagy toxikus citokin termelő helper T sektekbe transzfektálják (scFV konstrukció, Ig kapocs régió, CD3 zéta lánc ic rész) első- másod- harmadik generációs kiméra antigén receptorok linker „tumorantigént” felismerő scFV VH VL Ellenanyag kapocs régió Marcela V. Maus, Stephan A. Grupp, David L. Porter, and Carl H. June Antibody-modified T cells: CARs take the front seat for hematologic malignancies BLOOD, 24 APRIL 2014 x VOLUME 123, NUMBER 17 T sejt receptor CD3 zéta lánca és kostimuláló molekulák jelátvivő részei

105 Ellenanyag tisztítás antigén immunszorbensen (Affinitás kromatográfia)
oszlop polimer gyöngyök oszlop töltelék A gyöngyök („gyárilag”) aktivált oldalláncokkal lehetnek ellátva, amire egyszerű módszerekkel (magas pH) felköthetőek antigének. rákötött antigének affinity purifed antibody : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják.

106 tisztítandó ellenanyagok hozzáadása poliklonális ellenanyag
(animált ábra) tisztítandó ellenanyagok hozzáadása kötődés mosás elúció Antigén specifikus poliklonális ellenanyag

107 hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok
(animált ábra) Fordítva is összeállítható a rendszer: Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen oszlop polimer gyöngy Tisztítandó oldat felvitele oszlop töltelék Kötődés Mosás Elúció hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok Tisztított antigén

108 Immunprecipitáció (Nem azonos az antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos immunológiai reakcióknál tárgyalt precipitációs jelenséggel!!!)

109 gyakorlat

110 A POLIKLONÁLIS ELLENANYAG VÁLASZ
Immunszérum B-sejt készlet Ag Ag Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok

111 Immunoszorbens Oszlop sepharose gyöngyök BSA

112 Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció
(animált ábra) Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció

113 Nem kötődő fehérjék lemosása
(animált ábra) Nem kötődő fehérjék lemosása PBS Ha nem jön le több fehérje (pl. aspecifikus ellenanyag), a Coomassie festék barna marad. Coomassie Brillant Blue G250 festék

114 Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról
(animált ábra) Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról 4-5 ml glicin-HCl pufferrel mosni Arról, hogy a farkciószedés közben és végén az oszlopról jön-e még le fehérje, egy-egy Coomassie Brillant Blue-t tartalmazó csőbe cseppentéssel győződhetünk meg TRIS-t tartalmazó csövekbe gyűjtjük 9-10 cseppenként a frakciókat, hogy a pH neutralizálódjon

115 Monoklonális ellenanyagokat a sejtkultúra folyadékból („felülúszóból”)
Bakteriális protein A v. protein G oszlopokkal lehet hatékonyan tisztítani. Protein A, Protein G  az ellenanyagok Fc részét kötik meg (a baktérium így is védekezik az ellenanyagok általi felismerés ellen: lekötött Fc rész  nincs effektor funkció)

116 Újra klónozás limitált hígításos módszerrel (gyorsklónozás):
a hibridóma sejteket megszámoljuk 96 lyukú szövettenyésztő lemezre lyukanként 100 l tápfolyadékot kimérünk, majd az első lyukába (A1) sejtet 100 l-ben hozzáteszünk. Belőle felező hígításban a szövettenyésztő lemez-en lefelé, majd oldalirányban is hígítást végzünk: 100 l tápfolyadék/lyuk található a szövettenyésztő lemezen; Az első oszlopban a sejteket tartalmazó (A1-es) lyukból kivett 100ul sejtszuszpenziót hígítjuk lépésekben lefelé, majd az első oszlop lukait 200 l-re kiegészítjük. Ezután sokcsatornás pipettával hasonló módon sorozathígítást végzünk oldalirányban is) A szövettenyésztő lemez jobb alsó részén, így nagy valószínűséggel lesznek olyan lukak, amelyekbe csak 1 db sejt került. Felező hígítások A B D E F G H C Felező hígítások

117 Bürker kamra (3x3db 4x4-es rács)
25 négyzet (pirossal jelölve egy példa) vagy a hármas vonalak által a halványpirossal jelölt módon határolt terület nagysága: 1 mm2 A fedőlemez és a kamra felület távolsága: 0.1 mm Az így kapott térfogat: 0.1 mm3 = 10-4 cm3 (ml) a megszámolt sejtek száma × 104 × a korábbi hígításokkal =sejtszám/ml