ANTIGÉN, ELLENANYAG immunogenitás, tolerogenitás antigén fogalma

Az előadások a következő témára: "ANTIGÉN, ELLENANYAG immunogenitás, tolerogenitás antigén fogalma"— Előadás másolata:

1 ANTIGÉN, ELLENANYAG immunogenitás, tolerogenitás antigén fogalma
epitop (B-, T-sejt epitop) haptén hordozó antigén prezentáció T independens antigének szuperantigének immunoglobulinok ellenanyag szerkezete izotípusok ellenanyagok funkciói poliklonális és monoklonális ellenanyagok passzív immunizálás humanizált ellenanyagok ellenanyagok felhasználása gyakorlat: monoklonális ellenanyag termelő hibridóma sejt előállítása sejtszámolás gyorsklónozás ellenanyagok tisztítása affinitás oszlopon

2 ANTIGÉN IMMUNOLÓGIAI FOGALOM
Az adaptív immunválasz fogalomkörébe tartozik, B-, T-limfocitákkal, antigén receptorokkal, ellenanyagokkal kapcsolatban beszélünk antigénről. Szinte bármilyen kémiai szerkezet ((de olyan anyagok amik képesek fehérjékkel másodlagos kémiai kötést kialakítani!)) Oldott vagy részecske természetű Egyszerű vagy összetett Szervezetben képződő vagy külső környezetből bejutó Genetikailag saját vagy nem saját Természetes vagy mesterséges

3 Definíciók Antigén (Ag) - bármely olyan anyag, amelyet az érett immunrendszer felismer és vele szemben specifikus, fajlagos módon reagál (specifikus antigén receptor ismeri fel) Antigenitás: immunogenitás – az antigén képessége az (adaptív) immunválasz beindítására tolerogenitás – az antigén képessége az immunológiai tolerancia kiváltására, specifikus „immun-nemválaszolás” Ilyenek pl. a saját fehérjék

4 Az immunogenitást befolyásoló tényezők I.
A szervezet szempontjából: Idegen-saját (immunogén-tolerogén) Genetikai háttér faji hovatartozás (filogenetikai távolság: rokon fajoknak hasonlóak a fehérjéi) egyéni különbségek (pl. MHC molekulák eltérései) Életkor (újszülött – még nincsenek reagáló sejtjei, időskor – nem képződnek új limfociták) A szervezet fiziológiai állapota (pl. immunodefficiencia, éhezés) Az antigén szempontjából: Az antigén fizikai-kémiai sajátságai méret/komplexitás (nagyobb antigéntöbb epitop, „hordozó” szerepe) korpuszkula (sejt, kolloid) vagy oldott denaturált vagy natív (epitopok!) lebonthatóság (antigén prezentáció APC által) Hozzáférhetőség (saját szemlencse fehérjék elzártak az immunrendszertől) APC – antigen presenting cell, antigén bemutató sejt

5 Az immunogenitást befolyásoló tényezők II.
Immunizálási szempontból: Dózis Bevitel módja és útja Intradermális/szubkután > intravénás > orális > intranazális (a sorrend függ az antigéntől is!) Adjuvánsok fokozzák az immunrendszer antigén ingerre adott válaszát, de maguk nem immunogének pl: aluminiumsók, Freund-adjuváns, TLR ligandumok TLR – toll-like receptor AZ ADJUVÁNS HATÁS ÖSSZETETT: depó hatás  az antigén hosszantartó jelenléte a természetes immunitás aktiválása járulékos sejtek aktivációja

6 (animált ábra) Antigén: amit az immunrendszer felismer, és vele specifikus módon reagál (antigén receptorokkal, ellenanyagokkal) Antigén Antigén determinánsok avagy epitopok: az antigén azon részei amihez az antigén receptorok vagy az antigén specifikus ellenanyagok közvetlenül kötődnek (másodlagos kémiai kötőerők)

7 Antigén determináns avagy epitop
Az antigénnek az antigén receptorhoz közvetlenül kapcsolódni tudó része Az antigén azon része, melyet egy meghatározott immunglobulin (B sejt receptor vagy ellenanyag) vagy T sejt receptor ismer fel. T sejt epitopok esetében az antigén fehérjéből származó peptid egyes aminosavainak oldalláncairól szoktunk beszélni, de maga a T sejt receptor a megfelelő MHC molekulával (az MHC fehérje megfelelő pozíciójában levő aminosav oldalláncokkal) is kialakít kölcsönhatásokat.

8 B sejt epitop T sejt epitop (B sejtek ismerik fel) fehérjék
szénhidrátok lipidek nukleinsavak szteroidok stb. szöveti vagy oldott (T sejtek ismerik fel) peptidek (8-23 aminosav) (szigorú méretbeli kötöttség!) APC által történő bemutatás szükséges! (MHC molekulákon) glikolipidek, lipopeptidek - MHC szerű CD1 molekulák segítségével mutatja be az APC. A T sejtek néhány százaléka ismer fel ilyen antigéneket. APC – antigén prezentáló sejt

9 A KOMPLEX ANTIGÉNEK ELVI FELÉPÍTÉSE
Antigén determináns (avagy epitop) az antigén azon része, amelyet egy adott immunglobulin (B-sejt receptor, ill. ellenanyag), vagy T-sejt receptor felismerni képes Hordozó az immunglobulinnal vagy T-sejt receptorral közvetlenül nem reagáló rész (immunizálással, vakcinákkal kapcsolatban kerül elő ez a fogalom) Ezek a fogalmak csak az antigén és egy adott immunglobulin vagy T-sejt receptor viszonylatában értelmezhetők!

10 Antigén Epitop és „hordozó” Ellenanyag 1. Ellenanyag 2. (animált ábra)

11 antigén prezentáló sejt (APC)
(animált ábra) Az antigén bemutatás vázlatos folyamata CD8+ Citotoxikus T sejt CD4+ Helper T sejt Exogén fehérjék MHC I MHC II antigén prezentáló sejt (APC) A T sejt epitopok jó példák a lineáris epitopokra – a peptid elnyújtott, linearizált formában ül az MHC molekula kötőárkában A peptidek az antigén prezentáló sejtben képződnek enzimatikus hasításokkal az antigénből – jó példák a neoepitopokra Endogén fehérjék Az MHC molekulák chaperonnak tekinthetők, amik az antigénből származó (konformáció nélküli) peptid fragmentumot elnyújtott, stabilizált, bemutatható állapotban tartják a prezentáló sejt felszínén.

12 AZ ANTIGÉN DETERMINÁNSOK TÍPUSAI
lineáris determináns konformációs determináns (TCR, BCR, Ig) (BCR, Ig) konformációs determinánsok Ab2 Ab1 sejtfelszíni/hozzáférhető determináns hasítás Ig – immunoglobulin, ellenanyag A lineáris determináns elég megtévesztő elnevezés – itt is a konformáció a lényeg! Neoantigén, neoantigén determináns – valamilyen komolyabb fizikai kémiai behatás során jön létre. Irreverzibilis a változás ellentétben a rejtett/feltárt determinánssal (ami gyakran denaturáció, hőkezezelés, detergensek hatására jön létre) ami a kezelés „elmúlásával” újra el is tűnhet. Neoantigén létrejöhet az antigén hasításával, vagy gyakran reaktív molekulák kémiai kötődésével is (reaktív haptének, fém ionok). denaturáció rejtett/feltárt determináns új/neoantigén determináns konformációs/lineáris determinánsok WB  SDS hatására eltűnhet a konformációs determinánsok egy része, de előkerülhetnek rejtett determinánsok

13 Epitop térképezés (Epitop mapping)
fehérje antigén (aminosavlánc) PepScan: Az antigénből származó peptideket (amik lehetnek egymással átfedő szekvenciájúak is) microarray-szerűségre viszik, és ezt reagáltatják a a tesztelendő ellenanyaggal. Konformációs epitopok esetében nem hatékony. T sejt epitopok esetében megfelelő antigén prezentáló sejtekhez adják a különböző peptideket, és figyelik mely peptidek esetében történik sejtaktiváció. peptidek Ala-Scan: Ha már ismert melyik peptidre specifikus az ellenanyag/T sejt, a peptid szekvenciában meghatározhatók a konkrét kontaktusokat kialakító aminosavak. Peptidszintézissel kisebb peptidkönyvtárak hozhatók létre. Az aminosavakat egyesével módszeresen eltérő egyszerű aminosavra pl. alaninra cserélik, és figyelik hogy történik-e változás az ellenanyag kötődésben/T sejt aktivációban. V L G T R N I P S A L G T R N I P S V stb. Site directed mutagenesis - a mutációt a primerekbe teszik, PCR reakciókkal sokszorozzák fel, majd megfelelő gazda szervezetet transzfektálnak vele (pl. whole plasmid site directed mutagenesis esetén nincs is szükség rá, hogy megfelelő restrikciós helyek álljanak rendelkezésre a génszakaszok szabásvarrásához) T sejt epitopok hatékonyabban térképezhetők, mert lineáris epitopok. Konformációs epitopoknál a módszerek egy része nem alkalmazható. Genetikai módszerek: Site directed mutagenesis Phage display library

14 Az LPS antigén vagy PAMP/DAMP?
ha antigénreceptor v. ellenanyag ismeri fel PAMP ha mintázat felismerő receptor ismeri fel TLR4 TLR4 Az LPS molekula egy glökózamin epitopját specifikusan felismerő ellenanyag LPS LPS MD2 MD2 Fc LPS Fab Fab MD2 TLR4 LPS LPS TLR4 MD2

15 A B sejtek antigén általi aktivációja gyakran csak segítő T sejtek jelenlétében lehetséges
Mindkét sejt aktivációjával jár antigén CD40L A B sejtek által felismert antigének java része nem képes a B sejtek kellő aktiválására. Th sejtek segítsége szükséges az aktivációjukhoz, nélkülük nincs pl. izotípusváltás, memória sem. Az egyszerű bakteriális poliszaharid vakcinák nem képesek hosszútávú immunitást kialakítani. CD40 citokinek B sejt aktiváció, memória Vannak olyan antigének (pl. poliszaharidok) amik nem prezentálódnak

16 A B SEJTEK AKTIVÁLÁSA A T SEJTEK KÖZREMŰKÖDÉSE NÉLKÜL – „Tímusz independens antigének”
T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-1 T INDEPENDENS ANTIGÉN TI-2 B SEJT Az antigén különböző részei a BCR-hez és más sejtfelszíni receptorokhoz (pl. LPS-kötő receptor /CD14) egyidejűleg kötődnek Sűrűn elhelyezkedő, ismétlődő, azonos epitópok (pl. szénhidrát komponensek a mikroorganizmusok falában) BCR keresztkötéseket hoznak létre B SEJT AKTIVÁCIÓ más aktivációs szignált biztosít az antigén receptoré mellett extenzív receptor keresztkötés/aggregáció jön létre

17 Gyakorlati példa (pl. Prevenar - pneumokokkusz vakcina)
Baktériumok elleni immunizálásnál problémát jelent, hogy a vakcinában felhasználandó tisztított bakteriális poliszaharidok nem prezentálódnak, ezért nem aktiválnak T sejteket, így nem jön létre pl. memória B sejt válasz, ami a védettséget biztosítaná Ezért sok poliszaharid vakcinában a cukorláncokat immunogén fehérjéhez konjugálják, hogy T sejt dependens választ tudjon kiváltani. Egy ilyen célra használt fehérje a CRM197  módosított diftéria toxin (toxoid) (az eredeti fehérje egy aminosavát kicserélték (Glu  Gly) ami így nem toxikus) A toxoid megőrzi az immunogenitását és önmagában is képes lehet toxin ellenes blokkoló antitestek indukciójára. toxin Glu  Gly toxoid diftéria toxin – szekretált exotoxin, megkötődik a sejten, bejut és a sejten belül gátolja a protein szintézist pneumokokkuszból származó poliszaharidok

18 toxoidból származó peptid
A poliszaharid epitopot felismerő B sejt képes a hordozó fehérje peptidjeit prezentálni a T sejteknek toxoidból származó peptid toxoid poliszaharid MHCII TCR BCR segítő T sejt B sejt citokinek, CD40-CD40L poliszaharidot felismerő memória B sejtek ( ellenanyag termelő effektor sejtek)

19 + ‒ HAPTÉNEK Kis méretű molekulák, amelyek önmagukban nem képesek
immunválaszt indukálni immunválasz ‒ haptén (pl. DNP: dinitrofenil) + hordozó + haptén Nem kellően immunogén anyagok immunogenitása is növelhető azok hordozóhoz kötésével. Ilyen történhet egyes gyógyszerekel, reaktív vegyületekkel – pl. gyógyszerérzékenység

20 Limfocita aktiváció sajátságai
szabad haptén hordozóhoz kötött haptén Az antigén receptorokhoz asszociált Src típusú protein kinázok aktivációjának első lépése „auto”foszforiláció. A receptoroknak egymás közelébe kell kerülniük (antigén általi keresztkötés/aggregáció)

21 A HORDOZÓHOZ KÖTÖTT HAPTÉNEK ELLEN IRÁNYULÓ ELLENANYAGOK TÍPUSAI
hordozó+haptén ellenanyag/antitest hordozó specifikus haptén specifikus hordozó+haptén specifikus (konformációs epitop)

22 Hagyományos antigén prezentáció MHC+peptid komplex
SZUPERANTIGÉNEK Mikrobiális fehérjék. Immunválasz elkerülő mechanizmusok egyik fajtája. Antigén prezentáló sejt (APC) jelenlétében sokféle Vβ típusú T sejt receptort (TCR) hordozó T-sejthez tudnak kötődni. Poliklonális aktiválást eredményeznek. A kötődés nem függ a TCR antigén specificitásától. A szuperantigén az MHC molekulán és a TCR-on nem a peptidkötő helyre kötődik, hanem „kívülről” kapcsolja össze az MHC molekulát a TCR-ral Hagyományos antigén prezentáció MHC+peptid komplex TCR – T cell receptor Sokféle citokin termelődik nagy mennyiségban (TNFa – toxikus sokk), IL-4 és IL-10 – leregulálja az MHC és az IFNg expressziót sok sejttípuson - fokozza a későbbi „immunszuppresszált” állapotot Vbéta típusok – T sejt receptor génszintű átrendeződésénél a variabilis domének V-J vagy V-D-J régiók egymás mellé rendeződéséből jönnek létre. A létrejött TCR-ok küzül az endotoxin többféle V régióval rendelkező TCR-rel is képes lehet kapcsolódni, de vannak amikkel nem. Az ilyen módon aktivált T sejtek anergiásakká válnak vagy aktiváció indukált sejthalál áldozatai lesznek

23 Szuperantigének Konvencionális Antigén Szuperantigén 1:104 - 1:105
Fehérjék, melyek több – megfelelő TCR-t hordozó – T-sejthez tudnak kötődni és aktiválják azokat. Konvencionális Antigén Szuperantigén A szuperantigén stimulált sejtek sokféle citokint termelnek nagy mennyiségben. TNF-alfa – toxikus sokk szindrómáért felelős – szisztémás gyulladási reakció, keringés összeomlás, multiorgan failure IL-4 és IL-10 is nagy mennyiségben termelődik (Th2 sejtek) – MHC leregulódik a sejtek jelentős részén, a megmaradó Th1 sejtek és az IFNgamma függő citotoxikus sejtek gátlódnak. Monoklonális/Oligoklonális T sejt válasz  klonális osztódás 1: :105 aktiválódó sejtek aránya Poliklonális T sejt válasz és aktiváció indukált sejtpusztulás 1:4 - 1:10 aktiválódó sejtek aránya

24 B sejt szuperantigének (sokan a szuperantigéneket csak a T sejtekkel hozzák összefüggésbe, pedig a B sejt szuperantigénak is nagyon hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek) Az ellenanyag molekuláknak nem az antigén kötő részéhez hanem valamely más részéhez kötődnek. (pl. Fc rész) Kötődésük független az ellenanyag molekula specificitásától A szuperantigénhez kötött ellenanyag nem képes effektor funkciókat aktiválni. Képes lehet a B sejtek poliklonális aktiválására (SpA)

25 SZUPERANTIGÉNEK Osztályozás Forrás Endogén Exogén B sejt
Exogén B sejt 1.Mouse mammary tomor virus (MMTV) (retrovírus, integrálódik a genomba  endogén) Epstein-Barr virus asszociált szuperantigén (EBV) (az EBV valódi endogén retrovírális sz.antigént reaktivál)(HERV-K18, ERKV-18) Staphylococcal enterotoxins (SEs): A, B, C1 to C3, D, E, G to Q Staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) Staphylococcal exfoliative toxins: exoliatin A, exfoliatin B Staphylococcal enterotoxin-like toxins formed due to recombination within enterotoxin gene cluster: U2, V Streptococcal pyrogenic exotoxins (SPEs): A1 to A4, C, G to M Streptococcal mitogenic exotoxins: SMEZ Streptococcal superantigen :SSA Yersinia pseudotuberculosis: Yersinia pseudotuberculosis-derived mitogen (YAM) Mycoplasma species: Mycoplasma arthritidis-derived mitogen (MAM) Cholera toxin:  subunit A of cholera toxin Prevotella intermedia* Mycobacterium tuberculosis* Viral superantigens:  (a) Mouse leukemia virus                                         (b) IDDMK1222- Ppol-ENV-U3                                         (c) HIV-Nef                                         (d) Rabies virus-nucleoside protein Staphylococcal protein A Protein G Protein Fv (PFv) The superantigens can be broadly classified into following families: Endogenous superantigens: These superantigens are encoded by various viruses integrated into the genome. Examples are superantigens produced by mouse mammary tumor virus (MMTV). Mouse mammary tumor virus (MMTV) - retrovirus. It is integrating in the genome --> "endogenous" viral superantigen (MMTV encoded). Epstein-Barr virus (EBV) associated superantigen. The EBV LMP2A protein takes part in the reactivation of a real endogenous (former retroviral) superantigen: Human Endogenous Retrovirus Superantigen HERV-K18 (or ERVK-18) ii. Exogenous superantigens: These include the exotoxins secreted by microorganisms. Examples are staphylococcal enterotoxins (A, B, C1 to C3, etc.), streptococcal pyrogenic exotoxins (A1 to A4, C, etc) and others iii. B-cell superantigens: Those superantigens which stimulate predominantly B cells. Examples include staphylococcal protein A and protein Fv. .

26 Az immunglobulinok (Ig) szerkezete és funkciója

27 Immunoglobulinok (glikoproteinek)
Mobilitás alapján gamma-globulin Immunológiai funkció alapján antigén-specifikus fehérjék B sejt membránban antigén felismerő receptor BCR – B sejt receptor Testfolyadékokban (pl. szérum) ellenanyagok, antitestek

28 Az immunoglobulin szerkezete
Könnyű és nehéz láncok Diszulfid hidak láncok közötti láncon belüli immunoglobulin domén diszulfid híd NH2 szénhidrát Variabilis és konstans részek Kapocs régió COOH CH1 VL CL VH CH2 CH3 Domének VL & CL VH & CH1 - CH (CH4 pl. IgM) Oligoszaharid kapocs régió

29 Ribbon structure of IgG

30

31 ELLENANYAGOK IZOTÍPUSAINAK SZERKEZETI JELLEMZÉSE

32 Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések
Papain Fab (Fragment antigen binding) Ag kötés (valencia=1 monovalens) Specificitást a VH és a VL domének határozzák meg VH VL Fc – kristályosítható fragmentum (konstans, homogén) Fab – antigén kötő (Ag binding) fragmentum Fc (Fragment crystallizable) Effektor funkciók Fc Fab

33 Immunoglobulin fragmentek: Struktúra/Funkció összefüggések
Pepszin F(ab’)2 Antigén kötés bivalens! valencia=2 bivalens – képes lehet precipitációra, agglutinációra Fc peptidek + F(ab’)2 Az effektor funkciók egy részét nem képes indukálni, de képes lehet pl. agglutinációra/precipitációra (lásd következő szeminárium)

34 placentális transzfer kötődés az Fc receptorokhoz
Az immunglobulinok enzimes hasítása segített a szerkezet és funkció sajátságainak vizsgálatában antigén- kötés komplement kötő hely placentális transzfer kötődés az Fc receptorokhoz

35 Miért szükséges az Fc régió?
felismerni az antigént precipitálni az antigént (bivalencia!) blokkolni a toxinok vagy patogénnel asszociált molekulák aktív helyét (neutralizáció) blokkolni a gazdasejt és a patogénnek molekulái közötti kölcsönhatásokat (neutralizáció) az F(ab’)2 fragmentum képes sejtekkel kapcsolatos gyulladásos és effektor funkciókat a komplement rendszer gyulladásos és effektor funkcióit fagocitózist és az azt követő antigén prezentációs folyamatokat de Fc régió hiányában nem képes aktiválni

36 Egyeden belüli különféle antigéneket felismerő változatok
OSZTÁLY/ALOSZTÁLY ANTIGÉNKÖTŐ HELY A H-lánc (nehézlánc) konstans régiójának típusai, eltérő aminosav szekvencia Ig osztályok: IgG, IgA, IgE, IgD, IgM; alosztályok: IgA1-2, IgG1-4 (könnyűlánc izotípusok: κ, λ) A konstans szekvenciákban található allélikus változatok IgG – Gm allélek A H- és L-lánc variábilis (V) régióinak egyedi szekvencia variabilitása (klón-specifikus) (Ez felel a sokféle antigén specifikus megkötéséért!) Gm allotípusok kapcsolatban lehetnek egyes betegségekkel – pl. szklerózis multiplexszel Clin Immunol Immunopathol Nov;37(2): IgG (Gm) allotypes and multiple sclerosis in a French population: phenotype distribution and quantitative abnormalities in CSF with respect to sex, disease severity, and presence of intrathecal antibodies. Sesboüé R, Daveau M, Degos JD, Martin-Mondiere C, Goust JM, Schuller E, Rivat-Peran L, Coquerel A, Dujardin M, Salier JP. Proc Natl Acad Sci U S A Jul 22;105(29): Epub 2008 Jul 21. Plant-produced idiotype vaccines for the treatment of non-Hodgkin's lymphoma: safety and immunogenicity in a phase I clinical study. McCormick AA, Reddy S, Reinl SJ, Cameron TI, Czerwinkski DK, Vojdani F, Hanley KM, Garger SJ, White EL, Novak J, Barrett J, Holtz RB, Tusé D, Levy R. Plant-made vaccines have been the subject of intense interest because they can be produced economically in large scale without the use of animal-derived components. Plant-made therapeutic vaccines against challenging chronic diseases, such as cancer, have received little research attention, and no previous human clinical trials have been conducted in this vaccine category. We document the feasibility of using a plant viral expression system to produce personalized (patient-specific) recombinant idiotype vaccines against follicular B cell lymphoma and the results of administering these vaccines to lymphoma patients in a phase I safety and immunogenicity clinical trial. The system allowed rapid production and recovery of idiotypic single-chain antibodies (scFv) derived from each patient's tumor and immunization of patients with their own individual therapeutic antigen. Both low and high doses of vaccines, administered alone or co-administered with the adjuvant GM-CSF, were well tolerated with no serious adverse events. A majority (>70%) of the patients developed cellular or humoral immune responses, and 47% of the patients developed antigen-specific responses. Because 15 of 16 vaccines were glycosylated in plants, this study also shows that variation in patterns of antigen glycosylation do not impair the immunogenicity or affect the safety of the vaccines. Collectively, these findings support the conclusion that plant-produced idiotype vaccines are feasible to produce, safe to administer, and a viable option for idiotype-specific immune therapy in follicular lymphoma patients. Egyeden belüli különféle antigéneket felismerő változatok Egyeden belüli típusok Egyedek közötti változatok

37 Humán Immunglobulin Osztályok
IgG - gamma () nehézláncok IgM - mü () nehézláncok IgA - alfa () nehézláncok IgD - delta () nehézláncok IgE - epszilon () nehézláncok Izotípusok! könnyűlánc típusok kappa () lambda ()

38 A izotípusok között funkcionális különbségek vannak
vagy hexamer

39 Az ellenanyagok valenciája (kötésszáma)
2 Szabad IgM pentamer (”csillag”) 2 2 4 Antigénhez kötött IgM (”rák”) 10 vagy 12

40

41 Izotípusok a primer és szekunder immunválasz során
ellenanyagszint szekunder válasz az A antigénnel szemben primer válasz az A antigénnel szemben primer válasz a B antigénnel szemben napok Miért pentamer/hexamer a szolubilis IgM molekula?

42 Az antigén determináns és az ellenenyag antigénkötő ”zsebe” közötti kölcsönhatás modellje
A kapcsolatok kialakításáért a leginkább a variábilis régión belüli hivervariabilis részek felelősek Egyszerű modell, hogyan lehet elképzelni az antigén kötőhelyet (kötőfelszínt)

43 (a különböző aminosavak száma)
Complementary Determining Region (CDR) aminosav pozíció az Ig-lánc szekvenciájában (a különböző aminosavak száma) Variábilitás

44 AZ ELLENANYAGOK EFFEKTOR FUNKCIÓI
neutralizáció antigén kijelölése az effektor mechanizmusok számára

45 Az ellenanyagok effektor funkciói

46 Az ellenanyagok effektor funkciói
Későbbi szeminárium

47 NEUTRALIZÁCIÓ (az antigén kötéssel direkt módon összefüggő funkció)
A sejtek károsodnak/fertőződnek A sejteket megvédik a patogént/toxint neutralizáló ellenanyagok Immunizálás során a szervezetben képződő, vagy a passzív immunizálás során bejuttatott ellenanyagok így védenek: pl. vírusfertőzésk ellen, vagy toxinok hatását blokkolhatják, vagy baktériumok adhézióját gátolhatják az epitélsejteken (pl. vírus receptor és gazdasejt kapcsolódásának allosztérikus gátlásával)

48 Fc receptor mediált funkciók
γ  IgG kötés FcεR : ε  IgE kötés Fő FcR típusok: FcαR : α  IgA kötés FcRn „neonatális” Fc receptor Placenta, epitél sejtek, stb. IgG transzfer pIgR poli Ig receptor epitél sejtek IgA, IgM transzfer

49 OPSZONIZÁLÁS Opszonizáció nélkül a fagocitózis nagyságrendekkel kisebb hatékonyságal megy végbe

50 antitest függő celluláris citotoxicitás
Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity (ADCC) antitest függő celluláris citotoxicitás Az ellenanyag kötődis a sejtfelszíni antigénhez Az Fc-receptor keresztkötések aktiválják az NK sejt ölőmechanizmusait A célsejt apoptózissal elhal Az NK sejtek receptorai érzkelik a kötött ellenanyagokat nagyméretű sejt/patogén ellenanyaggal borítva Citotixikus granulumok tartalmának ürítése

51 Az előző ábrákon az ellenanyagok (több ellenanyag
Az előző ábrákon az ellenanyagok (több ellenanyag!) először hozzákapcsolódtak az antigénhez, és a kis affinitású Fc receptorok csak így voltak képesek kellően erős aviditással hozzákötni az antigén-antitest komplexhez. A nagy affinitású Fc epszilon receptor képes szabad IgE molekula megkötésére is aviditás – több egyedi affinitás összesített kötési ereje, ami nem azonos azok összegével, mert mértéke nagyságrendileg meghaladhatja az egyes affinitások összegét

52 FcεR általi HÍZÓSEJT DEGRANULÁCIÓ KIVÁLTÁSA
antigén specifikus IgE ellenanyagokkal Az FcεR-ok keresztkötése a specifikus IgE molekulákhoz kapcsolódó patogénen/allergénen keresztül IgE ellenanyaggal „felfegyverzett / szenzitizált” hízósejt degranuláció Az IgE szabad állapotban is képes kötődni a nagy affinitású FcεR receptorhoz. A sejt ilyen állapotban várja a találkozást az antigénnel patogén eliminálása (allergiás tünetek)

53 Ellenanyag izotipusok kapcsolata az effektor funkciókkal

54 bélrendszer, légzőrendszer nyálkahártya felszín
A poli Ig receptor, a szekretoros IgA és a transzcitózis J C S s A pIgR elhasadása teszi lehetővé az IgA leválását, ami a továbbiak során ezt a receptor darabot mint – szekretoros fragmentumot hordozza J C S s J C S s Az IgA és pIgR aktív folyamat révén vezikulákban átkerül az apikális felszínre J C S s Epitéliális sejt bélrendszer, légzőrendszer nyálkahártya felszín Ki kellene hangsúlyozni, hogy itt nem a placentáról van szó, hanem pl. bélrendszer, tüdő, tejtermelő mirigyek A pIgR és az IgA internalizációja A “poli Ig receptorok” (pIgR) az epiteliális sejtek bazolaterális felszínén találhatóak. Az itt található IgA (és IgM) ellenanyagokat szállítják az apikális felszínre J C S s B A szubmukóza B sejtjei dimer IgA-t termelnek

55 Mit szállít a pIgR? Hova szállít?
J lánccal rendelkező (polimer) izotípusokat: IgA, IgM (ez a J lánc nem összekeverendő a VJ/VDJ átrendeződés J régiójával!!!) Hova szállít? bél- és légzőrendszeri felszínek, szekrétumok (nyál, anyatej)

56 A neonatális Fcg receptor
Anyai IgG a magzatban: az IgG placentális transzportja A neonatális Fcg receptor Humán FcgRn Humán MHC Class I A placenta sejtek felveszik az anyai ellenanyagokat az anyai keringésből. Az endoszóma savas közegében az FcgRn megköti az ellenanyagokat (IgG specifikus), átszállítja a fötális oldalra, és az ott levő neutrálisabb pH hatására elengedi azokat. Egyes állatok esetében ez az előtejjel történik meg: Az újszülött bélrendszerében az FcγRn megköti a kolosztrumból származó anyai eredetü IgG-t (pH6.5). A receptor ezután transzcitózissal átszállítódik az epitéliumon és a megváltozott kémhatás hatására (pH 7.4) az IgG felszabadul és bekerül az újszülött állat keringésébe. (érdekesség- Az FcgRn és az MHC I molekula szerkezeti rokonságban áll.) Hasonló receptorok vannak az endotél sejtekben is. A pinocitózissal felvett ellenanyagokat ezek megkötik és visszaszállítják a felszínre – megmentik a lizoszómális lebontástól – növeli az ellenanyagok féléletidejét. Egérben nincs ilyen receptor, de bele lehet tenni – az ilyen egerekből sokkal több ellenanyag nyerhető ki (pl. diagnosztikai vagy kísérletes célokra) A placenta sejtek felveszik az anyai ellenanyagokat az anyai keringésből. Az endoszóma savas közegében az FcRn megköti az IgG-t, átszállítja a foetális oldalra, és az ott levő neutrálisabb pH hatására elengedi azokat. (Az FcRn és az MHC I molekula szerkezeti rokonságban áll)

57 FcγRn (neonatalis Fc receptor)
IgG és albumin szállítására képes. Különféle sejttípusokon van jelen: endothel sejtek epiteliális sejtek (emésztő és légutak) újszülött rágcsálók bélrendszerében 100x magasabb az expressziója mint az egyedfejlődés későbbi részében immunrendszer sok sejttípusa, APC-k

58 FcRn (FcγRn) működése pinocitózis
Az urogenitális traktusban, a rektumban és a felső légutak egy részében több az IgG, mint az IgA. Dendritikus sejtek cross-prezentációs folyamatában is lényeges szerepe van.

59 Az FcRn miatt az IgG szérum féléletideje kiugróan magas
FcγRn túlexpresszáló transzgenikus állatokban nagy mennyiségű ellenanyagot termeltethetünk

60 Nehéz láncú ellenanyag (hevy chain Ig, hcIg)
VHH fragment/nanobody antigén (lizozim) IgG: ember, egér, patkány hcIgG: tevefélék (Camelidae) teve, dromedár, láma immunoglobulin new antigen receptor (IgNAR): porcos halak, cápák Cápáknak vannak hagyományos ellenanyagai is (nehéz és könnyűláncú): IgM, IgW(IgD-hez hasonló) J Immunol Sep 15;191(6): doi: /jimmunol Epub 2013 Aug 9. Shark IgW C region diversification through RNA processing and isotype switching. Zhang C1, Du Pasquier L, Hsu E.

61 MONOKLONÁLIS ELLENANYAGOK POLIKLONÁLIS ELLENANYAGOK

62 A TERMÉSZETES ELLENANYAG VÁLASZ POLIKLONÁLIS
Poliklonális ellenanyag Immunszérum B-sejt készlet Ag Ag Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok (Több klón termékei, különféle epitopokat ismerhetnek fel)

63 Monoklonális ellenanyagok előállítása
Antigén specifikus ellenanyagokhoz legegyszerűbben immunizált élőlények szérumából juthatunk. Hosszú távon újabb és újabb immunizálást igényel. - Nehezen standardizálható - Limitált mennyiségben áll rendelkezésre Ha fel tudnánk szaporítani valamelyik B sejtet, ami „felismeri” az antigént, sokkal egyszerűbb volna a helyzet. Monoklonális ellenanyagok előállítása

64 Monoklonális ellenanyagok
(animált ábra) Antigén Monoklonális ellenanyagok Poliklonális ellenanyagok

65 Monoklonális ellenanyagok
egyetlen B-limfocita klón termékei homogének (antigénspecifitás, affinitás, izotípus) előnye a poliklonális ellenanyaggal szemben, hogy a meghatározott specificitású és izotípusú ellenanyagok nagy mennyiségben és azonos minőségben állíthatók elő osztódóképes – tenyészthető, egyféle ellenanyag termelő sejteket kellene előállítani - „in vivo” patológiás körülmények között is előfordulhat pl. mieloma multiplex esetében egy B sejt klón malignus szaporulata miatt nagy mennyiségű monoklonális ellenanyag lehet jelen („gammopátia” – rendelleneség a gamma globulin szérum frakcióban)

66 Myeloma multiplex A szérum elektroforézise monoklonális fehérje jelenlétét mutatja ki, amely további vizsgálattal lambda-könnyűláncú IgG-nek bizonyult. normál szérum a beteg széruma

67 Lehetőségek? Transzformáció/immortalizálás vírussal
EBV – humán B sejteket transzformál/immortalizál - Az antigén specifikus klónok elkülönítése körülményes - A vírus ott lesz a termékben is

68 Lehetőségek? Fúzió immortális sejtvonallal
Követelmények a fúziós partnerrel szemben ne legyen saját ellenanyag termelése ne befolyásolja a B sejtek ellenanyag termelését szelektálhatóság: könnyen megszabadulhassunk a felesleges, nem ellenanyag termelő sejtektől Kevés jó fúziós partner létezik: Egér: Sp2/0-Ag14 (SP2) Humán: nincs igazán jó általános fúziós partner! heteromielómákat, triómákat használnak fúziós partnerként: (maga a fúziós partner is 2-3 sejt hibridje - gyakran egér-humán hibrid) CB-F7, K6H6B5, H7NS, NAT-30, HO-323, A4H12

69 Lehetőségek? Mikromanipuláció (műszerigényes) „FuCell”

70 A B sejtet kontaktusba hozzák a fúziós partnerrel
antigén fluoreszcens/paramágneses jelzés B sejt Előre szelektált antigén specifikus B sejttel történik (jelölt antigénnel festés) A B sejtet kontaktusba hozzák a fúziós partnerrel Elektromos tér segítségével történik a fúzió Mivel nem szükséges szelektálni, jóval többféle humán fúziós partner szóba jöhet (szinte bármely immortális sejtvonal megfelelő) A fúzió folyamata

71 Monoklonális ellenanyagok előállítása
(Több módszer is létezik. A leg elterjedtebb: egér SP2 sejtvonallal végzett sejtfúzió alapú „hibridóma” módszert tekintjük át a következőkben) Georges J.F. Koehler és Cesar Milstein (Nobel díj 1984-ben) A hibridóma technika A számunkra értékes tulajdonsággal rendelkező, de korlátozott élettartamú immunsejtet kiválasszuk, és korlátlan ideig fenntarthatóvá, szaporíthatóvá tegyük. Antigén specifikus immunsejteket fuzionáltatunk korlátlanul szaporodó tumorsejtekkel. A kapott hibridek közül számunkra azok értékesek, amelyek kromoszomálisan stabilak, rendelkeznek az adott immunsejt tulajdonságaival (ellenanyag termelő vagy APC felismerő* képesség) és korlátlanul szaporodnak. *antigén specifikus, citokin termelésre képes, T sejt hibridómák is létrehozhatóak A megfelelő hibrid sejteket többlépéses szelekció végeredményeként, sejtklónok formájában kapjuk meg.

72 Monoklonális ellenanyag előállítás menete Vázlatosan
egér/patkány beoltása antigénnel a célsejteket tartalmazó lép vagy nyirokcsomók izolálása, homogenizálása lépből származó plazmasejtek és B-sejt eredetű egér tumorsejtek (plazmacitóma/ mielóma sejtek) fúziója Az ellenanyag termelő klónok szelekciója/azonosítása (több lépésben) A létrejövő hibridómák folyamatosan szaporodnak és ellenanyagot termelnek, ami a tápoldatukból kinyerhető (1.) (2.)

73 Sejtfúzió lépsejt mielómasejt (SP2) Napok alatt maguktól elpusztulnak
(animált ábra) Sejtfúzió lépsejt mielómasejt (SP2) PEG, Sendai virus, mikromanipulátor+nagyfrekvenciás elektromágneses mező Napok alatt maguktól elpusztulnak Szaporodó sejtek

74 Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny
1. szelekciós lépés Szaporodó sejtek lépsejt mielómasejt (SP2) HGPRT+ TK+ HGPRT- TK- Szelektív tápfolyadék („HAT”) érzékeny a normál sejtek napokon belül elpusztulnak HGPRT+ TK+ HGPRT- TK- (animált ábra)

75 Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek
2. Szelekciós lépés: Az ellenanyag termelő sejtek kiválasztása (animált ábra) Nem antigén specifikus ellenanyagot termelő, vagy ellenanyagot nem termelő hibridek Antigén specifikus ellenanyagot termelő hibridek Nincs jelen az antigénnel reagálni képes ellenanyag. Vannak a sejtkultúrában az antigénnel reagálni képes ellenanyagok. Eldobjuk Tovább tenyésztjük, sejtklónozzuk.

76 (ellenőrzés pl. ELISA módszerrel – lásd a későbbi gyakorlatokon)
(animált ábra) A sejtklónozás célja A kapott hibridómák összessége poliklonális ellenanyag keveréket termelne, melyek között előfordul antigénre nem specifikus is Különféle monoklonális ellenanyagokat termelő B sejt hibridóma klónok közül az antigénre specifikusakra van szükségünk (ellenőrzés pl. ELISA módszerrel – lásd a későbbi gyakorlatokon)

77 A „HAT” szelekció biokémiája
A szelektív tápfolyadék: A „HAT” szelekció biokémiája Hipoxantin, Aminopterin, Timidin tartalmú tápfolyadék nukleotid prekurzor gátlószer

78 ”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok
(animált ábra) A DNS szintézis két fő útja ”salvage” útvonal nukleinsav lebontási termékek felhasználása, purinok, hipoxantin, timin HGPRT, TK (hipoxantin guanin foszforibozil transzferáz, timidin kináz) nukleozid trifoszfátok DNS ”elemi” építökövek, egyszerü szerves anyagok, aminosavak, cukrok egyéb enzimek aminopterin HAT médium – Hipoxantin+Aminopterin+Timidin Az aminopterin az anyagcsere blokkoló. A hipoxantin és a timidin a salvage útvonal alapanyagai. Az SP2 mielóma sejtekben csak ez a „de novo” útvonal működőképes! (HGPRT‒, TK‒) ”de novo” útvonal

79 Technikai nehézségek:
A fúziós partner SP2 sejtvonalnak nincs saját ellenanyag termelése, és nincsenek HGPRT és TK enzimei. Ez teszi ideális fúziós partnerré! Technikai nehézségek: A transzformált sejtvonalak sajnos gyakran genetikailag instabilak. Ez a létrehozott hibridómákra is igaz. Rendszeresen ellenőrizni kell az ellenanyag termelésüket és antigénspecificitásukat – adott esetben újraszelektálni/klónozni Megtörténhet, hogy az SP2„magához tér”és aktív HGPRT és TK jelenik meg benne! Az ilyen SP2 sejtektől egy másik fajta szelekcióval szabadulhatunk meg:

80 ”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal
Hogyan hozható létre/tartható fent a HGPRT-, TK- (defficiens) fúziós partner sejtvonal? ”Abortív” hipoxantin és timidin analógokkal HGPRT- és TK- fúziós partner sejtek szelektálhatóak Ezek a pirimidin és purin vegyületek a HGPRT+ vagy TK+ sejtek esetében osztódáskor a ”salvage” útvonalon az örökítőanyagba épülve a sejtek pusztulásához vezetnek, élve hagyva a HGPRT- TK- sejteket.

81 A poliklonális és monoklonális ellenanyagok összehasonlítása
Poliklonális ellenanyag Kis affinitású Monoklonális Ea. Nagy affinitású Monoklonális Ea. Felismert antigén determinánsok száma több egy Specificitás (keresztreaktivitás) polispecifikus gyakran polispecifikus monospecifikus Affinitás kicsi-nagy (keverék) kicsi nagy Nem-specifikus immunglobulinok koncentrációja magas alacsony (0) Hozam (koncentráció) alacsony Előállítási költség Standardizálhatóság nem, ill. nehézkes egyszerű Mennyiség limitált korlátlan Gyakorlati felhasználhatóság módszer függő gyenge kiváló

82 Monoklonális ellenenyagok általános felhasználási lehetőségei
Immundiagnosztika (tumordiagnosztika - tumor spec mEA-gal) Sejttípusokra jellemző markerek azonosítása (differenciációs, aktivációs markerek) Immunhisztokémia Lymphomák tipizálása CD markerek segítségével - Sejtek elválasztása (pozitív – negatív szelekció –FACS, Panning, vasszemcsék mágneses térben) CD34+ csontvelői őssejtek gyűjtése autológ/allogén transzplantációhoz perifériás vérből Vércsoport meghatározás (anti-A, anti-B, anti-D ellenanyagokkal) Komplex antigén keverékek analizálása (Western, ELISA……) Sejtfelszíni és oldott molekulák funkcionális vizsgálata T-sejt aktiváltsági állapot vizsgálata / gátlása Célzott kemoterápia CD20+ B-sejtek elleni antitestek B-sejtes Non-Hodgkin lymphomában Szervátültetés utáni kilökődés megakadályozása célzott T-sejt gátlással Kovalensen kapcsolt, liposzómába zárt toxin Gyógyszer-eliminálás antitestekkel Digoxin-intoxikáció esetén digoxin ellenes antitestek

83 Passzív immunizálás I. VESZÉLYEZTETETT EGYED
egér monoklonális ellenanyagok Humán immunglobulin transzgenikus egér humanizált, egér monoklonális ellenanyagok immunizálás humán monoklonális ellenanyagok VÉDETT EGYÉN szérum ellenanyag (pl. véradás  vérkészítmény) VESZÉLYEZTETETT EGYED Az adaptív immunrendszer nem aktiválódik Azonnal hat Átmeneti védelem/hatás (Immunoglobulin lebomlás!)

84 Passzív immunizálás II.
Típus Alkalmazás Intramuszkuláris (kis mennyiségben jut be, kevésbé hatékony) HBV-Ig; Varicella-Zoster-Ig; Anti-D profilaxis Intravénás (IVIG) Humorális immundefektusok (Bruton-féle agammaglobulinaemia; hypogammaglobulinaemiával járó variábilis és kevert immundefektusok) Méreg elleni ellenanyagok (pl. kígyómarás) Természetes passzív immunizálás: Placentán átjutó IgG – újszülött védelme az első hónapokban Anyatej: IgA – emésztőrendszer és a felső légutak védelme

85 Poliklonális ellenanyagok terápiás felhasználása
mérgek elleni antiszérumok (Antivenom) kígyók, skorpiók, pókok, mérges tengeriherkentyűk mérgei elleni antiszérumok nagyméretű állatok fokozatos hiperimmunizációja (általában lovak) tisztított immunglobulin frakció kinyerése a plazmából - csökkenti az immunizálódás valószínűségét és mértékét; a többi szérumfehérje hiányában esetleg többszöri terápiás immunizálás is lehetséges

86 Monoklonális antitestek, mint beadható gyógyszerek?
Az egérben termelődő antitestek emberbe oltva -fajidegen fehérjeként - immunválaszt indukálhatnak. (ld. immunogenitást meghatározó tényezők – filogenetikai távolság!) Hogyan kerülhető meg a probléma?

87 A monoklonális antitestek evolúciója
Humán Egér / Patkány Kiméra Humanizált The participation in regulatory review allows the researcher reviewer a reality check for the real regulatory impact of the MOA data A humanizált ellenanyagok glikozilációja a termelő sejttípus (álalában egér) sajátságainak megfelelő. Létrehozhatók valódi humán monoklonális ellenanyagok humán hibridómák segítségével.

88 Gyógyszerként alkalmazott monoklonális ellenanyagok
- Tumorterápia Lehetővé tették a célzott, szelektív kemoterápia következő lépcsőfokának elérését (Sejttípus-specifikus, de még mindig nem csak a malignus sejtekre specifikus!) Immunszuppresszió Sejttípusra specifikus immunszuppresszió lehetősége

89 Monoklonális ellenanyagok a tumorterápiában
„Naked MAb”, nem konjugált antitest Anti-CD20 (rituximab – Mabthera/Rituxan, humanizált): B-sejtes Non-Hodgkin lymphoma Anti-CD52 (alemtuzumab – Mabcampath, humanizált): chronicus lymphoid leukaemia (3. vonalban, chlorambucil és fludara rezisztens esetekben) Anti-ErbB2 (trastuzumab – Herceptin, humanizált): emlőtumor Anti-VEGF (bevacizumab – Avastin, humanizált): colorectalis tu. (+ Lucentis!) Anti-EGFR (cetuximab – Erbitux, kiméra): colorectalis tu. (+ Vectibix, rekomb. humán!) 2. konjugált antitest Anti-CD20 + yttrium-90 izotóp (ibritumomab- Zevalin) Anti-CD20 + jód-131 (tositumomab – Bexxar, kiméra!)

90 Immunszuppresszív ellenanyagok
Anti-TNF-α antitestek infliximab (Remicade): 1998 óta, kiméra adalimumab (Humira): 2002, rekombináns humán Etanercept (Enbrel) – dimer fúziós fehérje, TNF-α receptor + Ig Fc-vég (Nem monoklonális antitest, csak Ig Fc-véget tartalmaz!) Anti-TNF-α terápia indikációi: Rheumatoid arthritis Spondylitis ankylopoetica (SPA - M. Bechterew) Plakkos psoriasis, arthritis psoriatica Crohn-betegség, colitis ulcerosa (általában - még - nem 1. vonal!)

91 Terápiás monoklonális antitestek elnevezése
A gyógyszerként használt monoklonális antitesteket generikus névvel illetik. A nevezéktan sémáját a WHO határozza meg. A nevezéktan részei: Például:Abciximabab- + -ci(r)- + -xi- + -mab, egy kardiovaszkuláris megbetegedésekben használt monoklonális kiméra ellenanyag.

92 old new meaning meaning Prefix Target substem Source substem variable
-anibi- — angiogenesis (inhibitor) -a- rat -ba(c)- -b(a)- bacterium -e- hamster -ci(r)- -c(i)- circulatory system -i- primate -fu(ng)- -f(u)- fungus -o- mouse -ki(n)- -k(i)- interleukin -u- human -le(s)- — inflammatory lesions -xi- chimeric (human/foreign) -li(m)- -l(i)- immune system -zu- humanized -mu(l)- — musculoskeletal system -xizu-* chimeric/humanized hybrid -ne(u)(r)- -n(e)-* nervous system -axo- rat/mouse hybrid (see trifunctional antibody) -o(s)- -s(o)- bone -toxa- -tox(a)- toxin -co(l)- -t(u)- colonic tumor Az immunszupresszív hatás esetleg opportunista fertőzéseket eredményezhet: wikipedia: The boxed warning for the drug rituximab (Rituxan, co-marketed by Genentech BioOncology and Biogen Idec) includes that JC virus infection resulting in progressive multifocal leukoencephalopathy and death has been reported in patients treated with the drug The boxed warning for the drug natalizumab (Tysabri, marketed by Elan and developed by Biogen Idec) includes that JC virus resulted in progressive multifocal leukoencephalopathy developing in three patients who received natalizumab in clinical trials. The boxed warning was added Feb. 19, 2009 for the drug efalizumab (Raptiva, marketed in the U.S. by Genentech, and marketed in Europe by Swiss drugmaker Merck Serono) includes that JC virus resulting in progressive multifocal leukoencephalopathy developed in three patients who received efalizumab in clinical trials. The drug was pulled off the U.S. market because of the association with PML on April 10, 2009. The JC virus or John Cunningham virus (JCV) is a type of human polyomavirus (formerly known as papovavirus) and is genetically similar to BK virus and SV40. It was discovered in 1971 and named after the two initials of a patient with progressive multifocal leukoencephalopathy (PML).[1] The virus causes progressive multifocal leukoencephalopathy (PML) and other diseases only in cases of immunodeficiency, as in AIDS or during treatment with drugs intended to induce a state of immunosuppression (e.g. organ transplant patients). -go(t)- testicular tumor -go(v)- ovarian tumor 'Suffix' (stem) -mab -ma(r)- mammary tumor -me(l)- melanoma -pr(o)- prostate tumor -tu(m)- miscellaneous tumor -vi(r)- -v(i)- virus

93 Ellenanyag tisztítás antigén immunszorbensen (Affinitás kromatográfia)
oszlop polimer gyöngyök oszlop töltelék rákötött antigének affinity purifed antibody : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják.

94 tisztítandó ellenanyagok hozzáadása poliklonális ellenanyag
(animált ábra) tisztítandó ellenanyagok hozzáadása kötődés mosás elúció Antigén specifikus poliklonális ellenanyag

95 hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok
(animált ábra) Fordítva is összeállítható a rendszer: Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen oszlop polimer gyöngy Tisztítandó oldat felvitele oszlop töltelék Kötődés Mosás Elúció hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok Tisztított antigén

96 Immunprecipitáció (Nem azonos az antigén-ellenanyag kapcsolódást követő másodlagos immunológiai reakcióknál tárgyalt precipitációs jelenséggel!!!)

97 gyakorlat

98 A POLIKLONÁLIS ELLENANYAG VÁLASZ
Immunszérum B-sejt készlet Ag Ag Aktivált B-sejtek Ellenanyag termelő plazmasejtek Antigén-specifikus ellenanyagok

99 Immunoszorbens Oszlop sepharose gyöngyök BSA

100 Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció
(animált ábra) Tisztítandó nyúl szérum hozzáadása Inkubáció

101 Nem kötődő fehérjék lemosása
(animált ábra) Nem kötődő fehérjék lemosása PBS Ha nem jön le több fehérje (pl. aspecifikus ellenanyag), a Coomassie festék barna marad. Coomassie Brillant Blue G250 festék

102 Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról
(animált ábra) Kötődő ellenanyagok eluálása az oszlopról 4-5 ml glicin-HCl pufferrel mosni Arról, hogy a farkciószedés közben és végén az oszlopról jön-e még le fehérje, egy-egy Coomassie Brillant Blue-t tartalmazó csőbe cseppentéssel győződhetünk meg TRIS-t tartalmazó csövekbe gyűjtjük 9-10 cseppenként a frakciókat, hogy a pH neutralizálódjon

103 Monoklonális ellenanyagokat a sejtkultúra folyadékból („felülúszóból”)
Bakteriális protein A v. protein G oszlopokkal lehet hatékonyan tisztítani. Protein A, Protein G  az ellenanyagok Fc részét kötik meg (a baktérium így is védekezik az ellenanyagok általi felismerés ellen: lekötött Fc rész  nincs effektor funkció)

104 Újra klónozás limitált hígításos módszerrel (gyorsklónozás):
a hibridóma sejteket megszámoljuk 96 lyukú szövettenyésztő lemezre lyukanként 100 l tápfolyadékot kimérünk, majd az első lyukába (A1) sejtet 100 l-ben hozzáteszünk. Belőle felező hígításban a szövettenyésztő lemez-en lefelé, majd oldalirányban is hígítást végzünk: 100 l tápfolyadék/lyuk található a szövettenyésztő lemezen; Az első oszlopban a sejteket tartalmazó (A1-es) lyukból kivett 100ul sejtszuszpenziót hígítjuk lépésekben lefelé, majd az első oszlop lukait 200 l-re kiegészítjük. Ezután sokcsatornás pipettával hasonló módon sorozathígítást végzünk oldalirányban is) A szövettenyésztő lemez jobb alsó részén, így nagy valószínűséggel lesznek olyan lukak, amelyekbe csak 1 db sejt került. Felező hígítások A B D E F G H C Felező hígítások

105 Bürker kamra (3x3db 4x4-es rács)
25 négyzet (pirossal jelölve egy példa) vagy a hármas vonalak által a halványpirossal jelölt módon határolt terület nagysága: 1 mm2 A fedőlemez és a kamra felület távolsága: 0.1 mm Az így kapott térfogat: 0.1 mm3 = 10-4 cm3 (ml) a megszámolt sejtek száma × 104 × a korábbi hígításokkal =sejtszám/ml