A protein S hiány diagnosztikájának nehézségei

Az előadások a következő témára: "A protein S hiány diagnosztikájának nehézségei"— Előadás másolata:

1 A protein S hiány diagnosztikájának nehézségei
Bereczky Zs, Tisza B, Muszbek L Debreceni Egyetem, Orvos és Egészségtudományi Centrum Klinikai Kutató Központ

2 A Protein S biokémiája 1977, DiScipio, Seattle
K-vitamin függő egyláncú glikoprotein, 70 kDa Szintézis helye: máj, endothel, megakaryocyták Megtalálható: plazmában, endothel felszínén, thrombocyta alfa granulumokban, Koncentrációja a plazmában: 10 mg/L, Féléletidő: 42.5 óra Trombin-szenzitív régió (E4): Cys47-72 loop EGF-domének 1-4 (E5-8): Ca2+-kötés, Kofaktor funkció SHBG-domén (E9-15) Szignál szekvencia, pre-és propeptid (E1-2) Gla-domén (E2): 11 glutamáton, Ca2+-kötés, PL-kapcsolódás Hidrofób régió (E3)

3 A plazmában csak 40% található meg szabad
formában, 60% nem kovalens C4bBP komplexben van. Alfa láncok Béta lánc C4bBP: akut fázis fehérje, -láncán kötődik PS-hez 1:1 arányú komplexet képeznek A kapcsolódásban a PS SHBG doménje (Gly605-Ile614) vesz részt. Csak a szabad forma antikoaguláns hatású

4 A Protein S funkciója 1. Kofaktor az APC mellett
PL felszínen 2-25x-re fokozza a FVa és FVIIIa bontást 2. Direkt inhibitor hatás A protrombináz és a tenáz komplexet is gátolja, FVa-hoz és FXa-hoz képes kapcsolódni A C4bBP-kötés csak az APC függő FVa inaktiváló hatást akadályozza, az APC-független hatások megmaradnak Koppelman, 1995, van de Poel, 2001

5 A protein C-protein S rendszer
szabályozása PS-PCa komplex Trombomodulin + Trombin PCI Protein S PS-C4bBP komplex Protein C Protein Ca-PCI Protein Ca C4bBP Trombin

6 Protein S gének (3p11.1-3q11.2) PROS1: 80kb 15 exon, 14 intron
ez az aktív gén PROS2: pseudogén exon homológia: 97% Exon 1 nincs inszerciók, deléciók, frameshiftek

7 Protein S deficiencia Öröklésmenet: AD Gyakoriság: 1:16,000
A thrombophilia oka: 3-5% 1984, Comp et al. Plazma szint 30%-65% totál heterozigótákban: 15%-50% szabad A heterozigóták tünetei: DVT (szokatlan lokal.), PE, Sync. necr. arteriás thrombosisok thrombophlebitis Homozigóták: < 5%, DVT, PE neonatalis purpura fulminans

8 Protein S hiány típusai
I. Normál PS molekula csökkent szintézise csökkent szabad (és totál) PS antigén csökkent PS aktivitás II. Kóros PS molekula normál szabad (és totál) PS antigén csökkent PS aktivitás

9 Protein S meghatározás lehetőségei
I. Antigén meghatározás 1. Totál PS (ELISA, immunturbidimetria) 2. Szabad PS (ELISA, ligand-kötő assay, immunturbidimetria) II. Funkcionális teszt - szabad PS

10 Szabad protein S antigén meghatározás
1/ Két dimenziós immunelektroforézis 2/ C4bBP-PS komplex eltávolítása PEG precipitációval, a felülúszóban maradó szabad PS meghatározása ELISA-val 3/ Csak a szabad PS-t felismerő két monoklonális antitest segítségével egy lépéses szendvics ELISA 4/ Ligand kötő assay ELISA lemezhez kötött C4bBP-t használnak a szabad PS megkötésére 5/ Latex-érzékenyített immunoturbidimetriás meghatározás, a szabad formát felismerő antitestpárral (Stago), vagy C4bBP+antiPS antitesttel (IL)

11 1. Immunoturbidimetriás meghatározás monoklonális anti-PS antitestpárral
+ + 2. Immunoturbidimetriás meghatározás C4bBP és monoklonális anti-PS antitest felhasználásával + +

12 A szabad protein S antigén meghatározás néhány gyakorlati kérdése
Leggyakrabban alkalmazott eljárások: ECAT NEQAS ELISA 37% 25% Immunturbidimetria 59% 75% Szabad protein S antigén koncentráció kifejezése: totál PS százalékában (elavult), vagy normál poolozott plazma szabad PS tartalmára közvetlenül kalibrálva

13 Protein S funkcionális teszt- APC kofaktor funkció
Beteg plazma hígítás Referencia/Kontroll plazma hígítás Protein S deficiens plazma APTI reagens (PL + aktivátor)-FXa/Tromboplasztin (PI)/RVV (Faktor Va) Aktivált Protein C 240 sec inkubáció 37oC-on 25 mM CaCl2 Az alvadási idő megnyúlás mértéke egyenesen arányos a vizsgálandó minta protein S aktivitásával. Ismert protein S aktivitású kalibrátor plazma alkalmazásával a másodpercben kapott alvadási idők protein S aktivitás értékekké konvertálhatók.

14 A protein S deficiencia diagnosztikáját
nehezítő tényezők Analitikai (metodikai), preanalitikai problémák: “PS deficiencia” a kémcsőben PS szintet befolyásoló tényezők: PS csökkenés valódi deficiencia nélkül Szerzett PS deficienciák Öröklött PS deficienciák: a genetikai diagnosztika problémái

15 (optikai koagulométerek) Kalibrátorok, aktivátorok
A PS funkcionális teszt eredményét befolyásoló tényezők Bi, lipid, Hgb (optikai koagulométerek) Kalibrátorok, aktivátorok Vérvételi cső Heparin, LMWH, heparinoidok APC rezisztencia Lupus anticoagulans Emelkedett FVIII A PS antigén meghatározást befolyásoló tényezők Reuma faktor, heterofil antitestek Inkubációs idő, hőmérséklet

16 Protein S meghatározását befolyásoló tényezők
Eltérő reagenskészletek szignifikánsan eltérő eredményeket adhatnak (kalibrációs plazmák, aktivátorok) Pl.: A és B reagens median: 49, 42% C és D reagens median: 64, 74%- p<0.001 (ECAT 2007) Jennings et al. JTH 2003; 1:1112-4 Bár mindhárom értékelt kit jelezte a PS deficienciát, a PS aktivitás értékek különböztek: 44.5, 27.7, 24.5%

17 2. Vérvételi cső: Kratz et al. Arch Pathol Lab Med. 2006;130:39-44.
A műanyag csőbe levett minta PS aktivitása szignifikánsan csökkent az üvegcsőhöz viszonyítva, de ez klinikailag nem okozott problémát üveg cső PS: 99.8 (30.2)%műanyag cső PS:94.3 (27.3)% 3. Emelkedett FVIII szint alámérést okozhat: általában 250% felett okoz problémát (PI alapú tesztnél FVII!) Hőmérséklet (szabad PS antigén meghatározás): Dahlback, Thromb Haemost 2001;86: A PS deficiens betegek hígított plazmájában a 37°C-on mért szPS ag 2x-ese a szobahőn kapott értéknek, ennek oka a PS-C4bBP hőmérséklet függő disszociációja.

18 Leiden mutáció esetén a PS deficiencia
II. típusának megítélése bizonytalan: Faioni et al. Thromb Haemost 1993;70: Jennings et al. JTH 2003;1: 3 különböző funkcionális tesztben alámérést okozott a FVLeiden mutáció Deitcher et al. Thromb Res 2003; 112:

19 6. Lupus anticoagulans jelenléte befolyásolhatja a funkcionális tesztet:
Rossi et al. Thromb Res 1992;65: PS aktivitás (%) szPS antigén (%) LA+betegek (n=16) 65   17 LA-betegek (n=17) 87   17 P NS Moraes et al. Pathology 2000;32:94-7. Az LA+ és - betegek PS értékei között nem talált különbséget.

20 Alkalmas-e a funkcionális protein S teszt önmagában a PS deficiencia szűrésére?
Rodger et al. Pathophysiol Thromb Haemost 2004;33:202-5. A funkcionális teszt szenzitivitása: 45.5%, specificitása: 95.3%, Neg. prediktív érték: 88.6%, Poz. prediktív érték: 68.5% PS deficiencia aluldiagnosztizált ha csak az aktivitás mérésére hagyatkozunk

21 A protein S szintjét befolyásoló (fiziológiás)
tényezők nem, életkor, hormonális státusz, hormonpótlás, oralis anticoncipiensek (a C4bBP is), terhesség (2. trimeszterben akár 45% alá is csökkenhet) életkor 1 nap FT PT 1 hó 6 hó felnőtt 36 (24-48) 26 (14-38) 63 (48-78) 56 (22-90) 87 (71-103) 82 (44-120) 92 (60-124) PS szint (%) Andrew, 1987, 1988, 1992 FT: érett úsz., PT: koraszülött

22 Valódi PS csökkenés SLE MM, tu. Kumarin terápia, K-vitamin def.
májbetegség Öröklött PS deficiencia DIC, Akut thrombosis APS Varicella, HIV Nephrosis C4bBP> PS:Ag Gyulladás C4bBP

23 Öröklött PS deficiencia genetikai diagnosztikája
A genetikai defektus jelenlétével legjobban a szPS antigén korrelál (II. típus nagyon ritka) Problémák: nagy gén, ezért a diagnosztika időigényes, pszeudo-gén miatt a PCR primerek tervezése nehézkes, a deficiencia hátterében nem mindig található meg a mutáció (intragén polimorf markerekkel, Southern blottal nagyobb gén defektusok azonosítása) Eddig több mint 150 különböző mutációt írtak le PROS1 adatbázis Polimorfizmusok: Pro626 CCA-CCG, intronK C54T, alternatív poliA szekvenciák, Ser460Pro: PS Heerlen- fokozott affinitás C4bBP-hez

24 Protein S gén-exon 9 A B

25 Protein S mutációs adatbázis www.isth.org
Mutáció típusa Előfordulási gyakoriság Nukleotid szubsztitúció 80% Misszensz mutáció 60% Nonszensz mutáció 23% Splice site mutáció 17% Inszerciók/deléciók 20% Nagy deléciók <1% Homozigóta vagy összetett heterozigóta: az esetek 3%-a II. típusú deficiencia: az esetek 5%-a

26 De Frutos et al. Thromb Haemost 2007;98:543-556.

27 A mutáció a Gla domén és a trombin szenzitív régió között
Beteg PS aktivitás (%) PS szabad antigén (%) FV Leiden Egyéb PS genetikai vizsgálat FI 54 60 vad típus - Pro42Thr heterozigóta FJ 41 53 KM 61 71 heterozigóta Mutáció nem detektálható LMK 46 75 emelkedett FVIII SBB 51 58 LA+ Exon 3: Pro42Thr Pro626 Lys177 A mutáció a Gla domén és a trombin szenzitív régió között egy kis amfipatikus helixben helyezkedik el.