A P elem technikák: enhanszerek és gének csapdázása

Az előadások a következő témára: "A P elem technikák: enhanszerek és gének csapdázása"— Előadás másolata:

1 A P elem technikák: enhanszerek és gének csapdázása
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: enhanszerek és gének csapdázása

2 A mutátor elem felépítése meghatározza a P elem mutagenezis jellegét
enhanszer csapdázás – génexpresszió, mutagenezis, klónozás Géncsapdázás – génexpresszió, mutagenezis, klónozás irányított génexpresszió – génfunkció vizsgálata, kölcsönhatások epitóp jelölés – géntermékek követése és tisztítása, in vivo analízis irányított génszupresszió – génfunkció vizsgálata, null fenotípus helyspecifikus rekombináció- génfunkció vizsgálata, többfunkciós gének irányított géncsere – mutagenezis, gén és protein funkció vizsgálata

3 A P-lacW enhanszer csapdázó elem felépítése
Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén lacZ mini-white ori amp E B Génexpresszió követését teszi lehetővé Marker gén lehetővé teszi a P elem követését Bakteriális szekvencia a DNS klónozást teszi lehetővé P{PZ} enhanszer csapdázó elemben a rosy marker gén található a mini-white helyett

4 A patched gén közelébe inszertálódott P-lacZ elem expressziós mintázata imágókorongokban
szárny szem

5 A P-Gal4 alapú enhanszer csapdázás mechanizmusa
Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén Gal4 mini-white ori amp E B Gal4 lacZ/gfp detektálás 5xUAS

6 GFP riporter expressziója P-Gal4 enhanszer csapdázó vonalakban

7 Enhanszer csapdázó inszerciók létrehozása
P-lacZ mutátor törzs transzpozáz forrás W- P(Δ2-3), Sb X Y TM6, Tb P(w+) P-lacZ W- P(Δ2-3), Sb W- X Y W- „jump-starter” hímek Y W- P-lacZ P-lacZ W- vagy Y lacZ expressziójának detektálása

8 A enhanszer csapdázás előnyei
A riporter gén expressziója speciális sejtmarkerként használható Követhetők a sejtek az egyedfejlődés során Egyedi identitást adhat a sejteknek olyan stádiumban, amikor morfológiailag még nem különülnek el Gyakran nem érinti a gén funkcióját, vagy hipomorf allélt eredményez Egyszerű mutációs analízist, és gyors klónozást tesz lehetővé

9 Az enhanszer csapdázás korlátai
Sok enhanszer csapdázó inszerció nem okoz mutációt Nem mindig egyértelmű, hogy egy enhanszer szekvencia melyik gén expresszióját befolyásolja Gyakran az érintett gén távol helyezkedik el az enhanszertől Egy riporter gén aktivitását egyszerre több enhanszer szekvencia is befolyásolhatja

10 A kettősen jelölő pGT1 géncsapdázó elem felépítése
SD Gal4 hs-neo mini-white promóter exon1 exon2 exon3 poli-A poli-A exon1 Gal4 mini-white exon2 exon3 poli-A w+ szemszín Gal4 lacZ/gfp detektálás 5xUAS

11 A P elem technikák: irányított génexpresszió
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: irányított génexpresszió

12 Irányított génexpresszió a Gal4 moduláris rendszerben - 1
Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén Gal4 mini-white ori amp E B Gal4 vizsgált gén 5xUAS

13 Irányított génexpresszió mechanizmusa -2
promóter UAS mini-white ori amp gén Gal4 mini-white ori amp

14 Enhanszer csapdázás különleges esete: sejtek eliminációja
Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén Gal4 mini-white ori amp E B Gal4 gyilkos gén 5xUAS ricin, diftéria toxin reaper, grim, hid tetanusz toxin

15 Az epitóp jelölés mechanizmusa
SD mini-white GFP FRT FRT FLP rekombináz SA SD promóter exon1 GFP exon2 exon3 poli-A GFP poli-A

16 GFP epitóppal jelölt proteinek kifejeződése