A P elem technikák: deléció izolálása P elem remobilizációval

Az előadások a következő témára: "A P elem technikák: deléció izolálása P elem remobilizációval"— Előadás másolata:

1 A P elem technikák: deléció izolálása P elem remobilizációval
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: deléció izolálása P elem remobilizációval

2 Bevezetés: P elem: mozgó genetikai elem- ugrásához transzpozáz szükéges Vad típusú P elem Laborban használt P elem P elem mobilizációhoz szükséges: mutátor elem transzpozáz elem Inszerció - nem mindig génbe inszertálódik - lehet a vizsgált gén közelében Remobilizáció lehet - precíz - nem precíz: inszerció, deléció Deléciós mutánsok izolálása

3 Deléció előállítása P elem remobilizációval
transzpozáz P elem vizsgált gén szomszéd gén

4 Deléciós mutánsok azonosítása
Fenotípus alapján: létfontosságú génben történt deléció letalitást okoz PCR-al: megfelelő primerekkel a kapott deléció mérete meghatározható P elem deléció PCR primer vizsgált gén

5 Deléció létrehozása egy X kromoszómás génben
1. Jumpstarter hímek előállítása: w, P(w+) / w, P(w+) ♀ ♀ X +/Y; Df(3L)C4/TM3, Sb P(Δ2-3) ♂ ♂ A legyek szeme piros a w+ miatt Sb: rövid szőr fenotípus Utódok: w, P(w+)/Y; +/ TM3, Sb P(Δ2-3) ♂ Jumpstarter hímek: piros szem, rövid szőr Jumpstarterek ivarsejtjeiben játszódik le a P elem mobilizációja.

6 w, ΔP/FM6, w; +/+ ♀ 2. P elem-hiányos kromoszómák azonosítása X
w, P(w+)/Y; +/ TM3, Sb P(Δ2-3) ♂ X Df(1)6C, w/FM6, w; +/+ ♀ ♀ balanszer kr-t hordozó nőstény jumpstarter hím FM6: első kromoszómás balanszer , Bar domináns mutációt hordozza w, ΔP/FM6, w; +/+ ♀ G1 utódok: fehér és Bar szemű, valamint hosszú szőrű ΔP ΔP jelöli a P elem hiányt A w, ΔP/FM6 genotípusú G1 utódok egy-egy olyan kromoszómát hordoznak, amelyből a P elem kiugrott. Ezt úgy is mondhatjuk, hogy a G1 utódok egy-egy „mutagenizált” kromoszómát reprezentálnak. A P elem kiugrása lehet pontos, vagy pontatlan.

7 3.lépés: törzsalapítás w, ΔP/FM6, w ♀ FM6, w/Y ♂ ♂ X X w, ΔP/Y ♂
törzsfenntartás A törzsalapító keresztezéseket a nem balanszeres w, ΔP/ Y hímek megjelenésére, vagy hiányára teszteljük. A w, ΔP/ Y hímek hiánya azt mutatja hogy a w, ΔP kromoszómán letális mutáció képződött. A keresztezésből származó fertilis utódok átrázásával fenntartható az új mutációt hordozó törzs.

8 A deléció kimutatása és méretének meghatározása
A kapott mutáns törzsekből genomikus DNS-t kell izolálni, majd megfelelő primerek segítségével a deléció mérete meghatározható. P elem vad típus Vizsgált gén mutáns Vad típusú PCR termék Deléció képződése esetén: mutáns PCR termék A deléciók mérete néhány bázispártól citológiailag látható nagyságig terjedhet.

9 A P elem technikák: deléció izolálása hímrekombinációval
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: deléció izolálása hímrekombinációval

10 Bevezetés: A P elem mobilizációja crossing overt okoz Drosophila ivar- és szomatikus sejtekben is, ahol rekombináció normálisan nem történik. A P elem indukált rekombinációt tanulmányozták osztódó ivarsejtekben a rekombináns kromoszómák struktúrájának vizsgálatával. Korábbi tanulmányok szerint a legtöbb P elem indukált hímrekombinációs esemény az inszercióval szomszédos szekvenciák delécóját vagy duplikációját váltja ki.

11 Három modell a P elem indukálta rekombinációs folyamatok magyarázatára
A P elem transzpozáz random vág a genomban, ahol a transzpozáz expresszálódik. Ezek rekombináns helyeket produkálnak. A hímrekobináció egy mellékterméke azoknak a kettősszálú töréseket javító mechanizmusoknak, amelyek a P elem kivágódása után következnek be. A P elem egy másik DNS duplexen elhelyezkedő P elemmel transzpozáz bekötődésével „hibrid elemet” alkot a sister kromatidákon.

12 A P elemet hordozó kromatidák rekombinánsok.
A B P elem C D Első lépésben a P elem jobb végéhez és a sister kromatidán lévő P elem bal végéhez transzpozáz kapcsolódik „hibrid elemet” formálva. A B C D A B C D A B C D Midkét végen duplaszálú törés következik be. A P elemek szabad végei target helyhez tapadnak, amivel rekombinációs mechanizmust indukálnak A B C D A B C D A B C D A B C D A B D A P elemet hordozó kromatidák rekombinánsok. A duplaszálú törések kijavításával a kromoszóma funkcionális lesz, de valószínűleg nem rekombináns. C D A B C D A B C A B C D

13 Hímrekombináció során a P elem mindkét oldalán képződik deléció, vagy duplikáció
A B C D A B C D független rekombinánsok száma A B D A B C C D A B B C D A C D

14 A hímrekombináció egy hőmérsékletfüggő folyamat

15 Rekombinánsok vizsgálata:
PCR-el DNS szekvenálással Komplementációs teszttel A kromoszómák citólógiai vizsgálatával Mutáns jelöltek A B C D Ms P-elem 3 kb 5 kb 3 kb 1 kb 0,5 kb

16 A deléciók mérete A deléciók mérete néhány bázispártól néhány száz kb.-ig terjedhet. A nagyobb deléciókat nem lehet PCR amplifikációval kimutatni. A nagyobb deléciók méretét komplementációs teszttel, és nyálmirígy óriáskromoszóma preparátumok citológiai analízisével határozzák meg. Az ábrán egy hímrekombinációval indukált deléció látható, amelynek mérete az 50C20-23 régiótól az 50D4-7 régióig terjed.

17 Mikor alkalmazzunk hímrekombinációt?
A vizsgálni kívánt gén közelében van P elem inszerció. Túl nagy génsűrűség esetén, amikor a P elem remobilizációval indukált deléció érintheti a szomszédos géneket. Vizsgált gén P elem Szomszéd gén DELÉCIÓ

18 Kísérlet deléciós mutánsok izolálására hímrekombinációval
P(w+) w- mutátor törzs w- P(w+) w- m transzpozáz forrás w- CyO,P(Δ2-3) m w- m marker mutációt hordozó törzs Y m

19 A rekombináns kromoszómákat a P elem és egy marker mutáció szegregációjának változása alapján lehet azonosítani P(w+) + gén gén marker P(w+) marker gén

20 w- w- X w- Y mutátor törzs w- w- X w- Y w- w- w- Y m m m m m
P(w+) w- w- m X w- Y m CyO,P(Δ2-3) P(w+) mutátor törzs P(w+) w- w- m X m Y w- CyO,P(Δ2-3) m „jumpstarter” hím P(w+) P(w+) w- m w- m w- m Y m

21 A rekombináns kromoszómák fenntarthatók a balanszerrel szemben.
Törzsalapítás P(w+) w- m w- m Tm3, Sb, Ser w- X / w- Tm6,Tb, Hu P(w+) w- m Y m P(w+) w- m / w- m P(w+) P(w+) w- Homozigóta életképes m X Y Tm6,Tb, Hu P(w+) w- m / A rekombináns kromoszómák fenntarthatók a balanszerrel szemben. Y Tm6,Tb, Hu Homozigóta letális

22 A P elem technikák: transzgénikus állatok előállítása
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: transzgénikus állatok előállítása

23 Transzgénikus legyek előállítása P elem mikrionjektálással
A kívánt DNS szakasz vagy szakaszok P elem végek közé vannak helyezve egy plazmidban amit transzpozáz jelenlétében injektálnak M citotípusú pre-blasztoderma állapotban lévő embriókba. 5’-vég 3’-vég white bakteriális szekvencia Hsp70 EcoRI, KpnI, BamHI, XbaI, HpaI, XhoI, PstI klónozó hely Transzpozáz forrás biztosítása: - tisztított transzpozáz fehérje a plazmidhoz kötve - „helper” plazmiddal történő együttes injektálás - endogén transzpozáz forrást tartalmazó legyekbe történő injektálás

24 Az embrionális fejlődés korai állapotai
Megtermékenyített pete 30 percel megtermékenyítés után. A magi osztódások 10 percenként követik egymást egy sokmagvú sejtet a sinciciális blasztodermát létrehozva. Kb 9 osztódás után (512 mag) a sejtmagok kivándorolnak a felszínre A felszínen további négy osztódás történik. A sejteknek egy kis csoportja, a polsejtek kb. 2.5 óra múlva formalódnak a posterior végen. Ezekből lesznek a felnőtt állat ivarsejtjei. Három órával a megtermékenyítés után a sejtmagokat memrán zárja körül és a sejtek egy réteget képeznek az embrió felszínén, ez a sejtes blasztoderma állapot.

25 Az injektálás főbb technikai problémái
a pete belső nyomása 2. az injektálás során keletkező „lyuk” befedése Megoldások: Az embrió kontrollált körülmények között végzett szárítása az injektálás előtt Zalokar: a lyuk befedése heptánban oldott gum demarral Ilmensee: kezelés 1.2 % sulfoszalicilsav oldattal -Geyer-Duszynska: a beavatkozás halokarbon olaj alatt történik

26 Szükséges eszközök Mikroszkóp, vibráció mentes asztal Mikromanipulátor
Egyszerű mikromanipulátor elégséges. Tű – tűhúzó - kapilláris A tű hegyének élesnek kell lennie, 1-10 mm átmérővel. Injektáló rendszer Lehetővé teszi a tű tartalmának folyását amikor az az embrióban van és nem engedi azt amikor a tű az olajban van. - vizzel töltött - olajjal töltött - levegős rendszer

27 Az injektálás menete 0. A kívánt konstrukt előállítása
1. Az emriók preparálása - petéztetés -dekorionálás -sorbarakás Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó Ó -szárítás (a térfogat 1-5 %-a) 2. Injektálás 1-100 pl oldat 3. Gondviselés

28 Összefoglalás keresztezés nem transzformált, w- szemű állatokkal
donor DNS-t hordozó sejtmagok ivarsejt prekurzor transzpozáz gén marker w+ allél transzgén 3’-P hibás 5’-vég 5’-P nem autonóm P elem donor plazmid w- szemű GO állatok keresztezés nem transzformált, w- szemű állatokkal injektálás w- embriókba sejtmagok donor DNS-t hordozó és w+ szemű transzgénikus utódok w- szemű nem transzgénikus utódok