Cianobaktériumok izolálása és megszámlálása Készítette: Horváth Attila.

Az előadások a következő témára: "Cianobaktériumok izolálása és megszámlálása Készítette: Horváth Attila."— Előadás másolata:

1 Cianobaktériumok izolálása és megszámlálása Készítette: Horváth Attila

2 Cianobaktériumok Prokarióta mikroorganizmusok Fotoszintetizálnak, így O 2 -t termelnek Megjelenési formáik –Egysejtűként –Telepes szerkezetben –Fonalas formában Átlagos sejtméretük 1-6 μm Nitrogén megkötésre képesek -> talaj revitalizációra is szokták alkalmazni

3 Tálcák előkészítése A cianobaktériumokat szaporítás után konzerválni kell, nem szabad hűtőben tartani, más prokariótákkal ellentétben A következő dián látható 2 közegből egyet kiválasztunk Ezt 121 °C-on 20 percig sterilizáljuk, használat előtt 48 °C-os vízfürdő 4 hígítási tartomány kijelölése, ahol optimális a baktérium számlálás 1 ml kevert szuszpenziót kimérünk egy steril Petri-csészére 1 ml-es steril pipettával, a leghígabb oldattal kell kezdeni Öntsünk 15 ml tápoldatot a Petri-csészére, óvatosan össze kell keverni Ha a tápközeg megszilárdult, fordítsuk meg és tegyük inkubátorba

4 Alkalmazható tápközegek 1. Tápoldat A (Allen 1968) 1.500 g NaNO 3 0,039 g K 2 HPO 4 0,075 g MgSO 4 *7H 2 0 0,020 g Na 2 CO 3 0,027 g CaCl 2 0,058 g Na 2 SiO 2 *9H 2 O 0,001 g EDTA 0,006 g citromsav 0,006 g Vas-citrát 1000,000 ml desztillált víz 1,000 ml mikroelem oldat A pH-t 7,8-ra kell beállítani 1 ml mikroelem oldat tartalmazza : 2,8600 g H 3 BO 4 1,8100 g MnCl 2 *7H 2 O 0,2220 g ZnSO 4 *7H 2 O 0,3910 g Na 2 MoO 4 *2H 2 O 0,0790 g CuSO 4 *5H 2 O 0,0494 g Co(NO 3 ) 2 *6H 2 O 1000,000 ml desztillált víz A szilárd táptalaj előállításához 1,5 % autoklávban csírátlanított agart (48 °C) adunk az oldathoz.

5 Alkalmazható tápközegek 2. Tápoldat B (Castenholz 1970) 0,100 g nitrilo-triecetsav 0,060 g CaSO4*2H20 0,100 g Mg SO4*7H2O 0,008 g NaCl 0,103 g KNO3 0,689 NaNO3 0,111 g NaHPO4 1,000 ml FeCl3 oldat (0,2905 g/l) 0,500 ml mikroelem oldat 1000,000 desztillált víz A pH-t 8,2-re állítjuk NaOH, ami az autokláv után 7,-7,6-ra áll be 1 ml mikroelem oldat tartalmazza : 2,280 g MnSO 4 *H 2 O 0,500 g ZnSO 4 *7H 2 O 0,500 g H 3 BO 4 0,025 g Na 2 MoO 4 *2H 2 O 0,025 g CuSO 4 *5H 2 O 0,045 g CoCl 2 *6H 2 O 0,500 ml H 2 SO 4 1000,000 kétszer desztillált víz A szilárd táptalaj előállításához 1,5 % autoklávban csírátlanított agart (48 °C) adunk az oldathoz.

6 Szilárdított agart tartalmazó Petri- csésze A tápközeg sterilizálása autoklávban 120 °C-on 20 percig zajlik, majd lehűtés 48 °C-ra 15 ml tápoldatot öntsünk minden Petri-csészére és hagyjuk megszilárdulni az agart A csészéket 2 napig pihentetjük szobahőmérsékleten viszonylag védett helyen vagy inkubátorban A nem azonnal felhasznált csészéket hűtőben tárolhatjuk 4 hígítási tartományt jelölünk ki a megfelelő sejtszám meghatározásért 0,1 ml-es alikvot mintákat mérünk ki 3 párhuzamos mérésre minden hígításból, kezdve a leghígabbal Steril üveg szélesztőbottal terítsük szét a szuszpenziót Fordítsuk le a csészét és tegyük inkubátorba

7 Cianobaktériumok számlálása Legvalószínűbb élősejtszám módszer (Most probable Number Method- MPN) Mikroorganizmusok jelenlétét vagy hiányát vizsgálja a talajok vagy más anyagok egymást követő hígításainak különböző egyedi részeiben Oldatok Megfelelő szubsztrátnak az alábbi tápanyag oldatok egyikét vagy egy másik standard tápanyag oldatot használjunk Bristol oldat (A) -1,0 g NaNO 3 -1,0 g K 2 HPO 4 -0,3 g MgSO 4 7H 2 O -0,1 g NaCl -Nyomnyi FeCl 3 *6H 2 O 800 ml desztillált vízben feoldva és 1000 ml-re feltöltve Wilson oldat (B) -1,00 g Ca(NO 3 ) 2 -0,25 g K 2 HPO 4 -0,25 g MgSO 4 7H 2 O -0,25 g KCl -0,30 g FeCl 3 *6H 2 O 800 ml desztillált vízben feoldva és 1000 ml-re feltöltve

8 (A) Bristol-oldat –8 unciás csavaros tetejű palack –36 gömbölyű üveggyönggyel –A gyöngyök a talaj aggregátumokat szedik szét –95 ml víz (B) Wilson-oldat –8 unciás csavaros tetejű palack –90 ml víz –Üveggyöngyök nélkül Egy talajmintához szükséges 1 vakminta gyöngyökkel és 7 anélkül

9 Számlálás előkészítése Minden talajmintához készítsünk 1 vak hígítást 95 ml vízzel és 15- 20 gyönggyel, illetve 7-et gyöngyök nélkül, 90 ml vízzel Zárjuk rá kupakokat, és tegyük 121 °C-os autoklávba, 20 percre, majd hűtsük le szobahőmérsékletre Tegyünk 10 g talajt a 95 ml vizet tartalmazó üres hígításos palackba. 10 percig keverjük vízszintesen a dugattyús keverőben, majd kézzel is rázzuk össze Azonnal mérjünk ki pipettával 10 ml-t a 90 ml-es üres hígításos palackba. -> ez lesz a 10 -2 hígítási tag Folytassuk a hígítást addig, amíg megfelelő tartományt el nem értünk (10 -7 -10 -9 hígítás) Minden sikeres hígításból 1ml-t bemérünk a inkubációs-csónakba 4 hétig 22 °C-on inkubáljuk szórt napfény, izzó vagy fluoreszcens fény mellett

10 A beoltott konténerekben hetente egyszer vizsgáljuk meg a cianobaktérium szaporodását, ami felismerhető felszíni gyűrűk vagy hártyák alapján Mikroszkópban közvetlen vizsgálatot folytathatunk Rögzítsük az egyes hígításokban előforduló baktériumok számát Ebből meghatározható a legvalószínűbb élősejtszám (MPN)