Akut toxicitásvizsgálat halembrióval OECD 212 Készítette: Fodor Anna.

Az előadások a következő témára: "Akut toxicitásvizsgálat halembrióval OECD 212 Készítette: Fodor Anna."— Előadás másolata:

1 Akut toxicitásvizsgálat halembrióval OECD 212 Készítette: Fodor Anna

2 A teszt alapelvei Rövidtávú teszt, amely a halak megtermékenyítésétől a lárvaállapotig terjedő életszakaszt vizsgálja Rövidtávú teszt, amely a halak megtermékenyítésétől a lárvaállapotig terjedő életszakaszt vizsgálja Cél: a vizsgált vegyi anyag letális, szubletális dózisának meghatározása Cél: a vizsgált vegyi anyag letális, szubletális dózisának meghatározása Halembrió; sac-fry állapot [1.]

3 A vizsgált halfajok Amerikai ponty [2.] Szivárványos pisztráng [3.] Közönsége ponty [4.] Japán rizshal [5.] Zebrafhal [6.]

4 A vizsgált halfajok 2. Életszakasz hossza [nap] Túlélők a kontrollcsoportban [min%] Fajok Hőmérséklet [°C] Fotoperiódus [h] EmbrióSac-fryTesztidőtartamaSikeres keltetés keltetésUtókeltetés Brachydanio rerio Zebrafish 25 ± 1 12-163-58-10 8-10 nap 8090 Oncorhynchus mykiss Rainbow trout 10 ± 1 030-3525-30 50-55 nap 6670 Cyprinus carpio Common carp 21 - 25 12-165>4 8-9 nap 8075 Oryzias latipes Japanese ricefish 24 ± 1 12-168-114-8 13-16 nap 8080 Pimephales promelas Fathead minnow 25 ± 2 164-55 8-9 nap 6070

5 Vizsgált vegyi anyag Tulajdonságai: Gőznyomás Gőznyomás Vízoldhatóság Vízoldhatóság Szerkezeti képlet Szerkezeti képlet Stabilitás Stabilitás Disszociációs állandók Disszociációs állandók Biológiai bonthatóság Biológiai bonthatóság [7.]

6 A teszt leírása Tesztkamrák Üvegből, vagy más kémiailag semleges anyagból készülnek Üvegből, vagy más kémiailag semleges anyagból készülnek A kamrákat a tesztterületen véletlenszerűen kell elhelyezni A kamrákat a tesztterületen véletlenszerűen kell elhelyezni Külső hatásoktól való védelem Külső hatásoktól való védelem Tesztegyedek kiválasztása Az ajánlott fajokat táblázat tartalmazza Az ajánlott fajokat táblázat tartalmazza A tenyészhalak tartási körülményeit az OECD 210. tartalmazza A tenyészhalak tartási körülményeit az OECD 210. tartalmazza

7 A tesztkörülmények Embriók, lárvák kezelése Elhelyezés rácson vagy szűrőn Elhelyezés rácson vagy szűrőn Hígító víz Meghatározott összetétel (5. melléklet) Meghatározott összetétel (5. melléklet) pH: max eltérés 0,5 pH: max eltérés 0,5 Állandó összetétel Állandó összetétel Teszt oldat Törzsoldat készítése víz segítségével Törzsoldat készítése víz segítségével Megengedett oldószerek: aceton, metanol, etanol, dimetil-formamid Megengedett oldószerek: aceton, metanol, etanol, dimetil-formamid Félstatikus módszernél: törzsoldat összetétele ne változzon Félstatikus módszernél: törzsoldat összetétele ne változzon Átfolyásos módszer: törzsoldat folyamatosan hígul Átfolyásos módszer: törzsoldat folyamatosan hígul Halembriók [7.]

8 A tesztkörülmények Időtartam Teszt megkezdése a megtermékenyítés után 30 mp-cel, vagy max. 8 órán belül Teszt megkezdése a megtermékenyítés után 30 mp-cel, vagy max. 8 órán belülFeltöltés 3 párhuzamos minta egy adott koncentráción 3 párhuzamos minta egy adott koncentráción Oxigén koncentráció minimum 60% Oxigén koncentráció minimum 60% Betelepítési arány: min. 0,5 g/l Betelepítési arány: min. 0,5 g/l Fény, hőmérséklet 3.; 4. mellékletben fajonként meghatározva 3.; 4. mellékletben fajonként meghatározva Kísérleti koncentrációk 5 tagú hígítási sor 5 tagú hígítási sor Diszpergálószer: max. 0,1 ml/l Diszpergálószer: max. 0,1 ml/l Kontroll oldat: csak hígító vizet tartalmaz Kontroll oldat: csak hígító vizet tartalmaz Lárva [7.]

9 Teszthez szükséges készülékek pH mérő pH mérő Oxigénmérő Oxigénmérő Lúgosságmérő Lúgosságmérő Mérleg Mérleg Kémiailag semleges anyagból készült tartályok Kémiailag semleges anyagból készült tartályok [8.] [9.]

10 Mérés, analitika Vizsgálat alatt folyamatosan mérni kell a vegyi anyag koncentrációját a tesztoldatban Vizsgálat alatt folyamatosan mérni kell a vegyi anyag koncentrációját a tesztoldatban Félstatikus módszer: legalább a legnagyobb és legkisebb koncentráció elemzése, 3-szor a mérés alatt Félstatikus módszer: legalább a legnagyobb és legkisebb koncentráció elemzése, 3-szor a mérés alatt Átfolyásos módszer: ugyanaz, mint a félstatikusnál, ha a vizsgálat időtartama több mint 7 nap mintavételek számát növelni kel Átfolyásos módszer: ugyanaz, mint a félstatikusnál, ha a vizsgálat időtartama több mint 7 nap mintavételek számát növelni kel A mérés alatt 3-szor mérni kell az oldott oxigéntartalmat, pH-t és hőmérsékletet minden koncentrációnál, az összkeménységet és a sótartalmat a legmagasabb koncentrációjú oldatnál A mérés alatt 3-szor mérni kell az oldott oxigéntartalmat, pH-t és hőmérsékletet minden koncentrációnál, az összkeménységet és a sótartalmat a legmagasabb koncentrációjú oldatnál

11 Megfigyelések Folyamatosan fel kell jegyezni: A kikelt peték és a túlélők számát (első 3 órában 30 percenként), az elpusztult előlényeket el kell távolítani ( peték: áttetszőség csökkenése, színváltozás; embriók: testmozgás hiánya, szívverés megszűnése; lárvák: mozdulatlanság) A kikelt peték és a túlélők számát (első 3 órában 30 percenként), az elpusztult előlényeket el kell távolítani ( peték: áttetszőség csökkenése, színváltozás; embriók: testmozgás hiánya, szívverés megszűnése; lárvák: mozdulatlanság) A rendellenes küllemet A rendellenes küllemet Kóros viselkedést Kóros viselkedést Lárvák hosszát, súlyát Lárvák hosszát, súlyát A vizsgálat végén a következő adatoknak kell rendelkezésre állniuk: Kumulált mortalitás Kumulált mortalitás Egészséges lárvák száma Egészséges lárvák száma Kikelt lárvák száma/nap Kikelt lárvák száma/nap A kikelés időtartama A kikelés időtartama Túlélő állatok hossza és tömege Túlélő állatok hossza és tömege Rendellenes lárvák száma Rendellenes lárvák száma Abnormális viselkedésű lárvák száma Abnormális viselkedésű lárvák száma

12 A mérés végpontja Regressziós modell alapján megbecsülhető az EC20 és EC50 A NOEC (megfigyelhető hatást még nem okoz) és a LOEC (megfigyelhető hatást okozó legkisebb koncentráció) meghatározható a kontrolloldattal való összehasonlítás által

13 Eredmények értékelése Statisztikai módszerekkel (regresszióanalízis, varianciaanalízis) Statisztikai módszerekkel (regresszióanalízis, varianciaanalízis) LOEC, NOEC meghatározása becsléssel LOEC, NOEC meghatározása becsléssel LC50 és EC50 meghatározása LC50 és EC50 meghatározásaAhol P: korrigált túlélési % P’: megfigyelt túlélők aránya C: kontrollban lévő túlélők aránya

14 Források OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS (21 2 ) [1.] http://www.flickr.com/photos/oregonwild/480489158/ [2.] http://pond.dnr.cornell.edu/nyfish/Cyprinidae/cyprinidae.html [3.] http://www.mountainanglers.com/Rainbow-Trout.html [4.] http://pond.dnr.cornell.edu/nyfish/Cyprinidae/cyprinidae.html [5.] http://embryology.med.unsw.edu.au/OtherEmb/EmbHome.htm [6.] http://www.photonics4life.eu/P4L/Research/International-Projects/Integrated- zebrafish-detector-EmbryoSort [7.] http://www.lssu.edu/arl/eggs.php http://www.lssu.edu/arl/eggs.php http://www.ag.auburn.edu/fish/image_gallery/details.php?image_id=597 [8.] http://www.shutterstock.com/pic-9779923/stock-vector-three-flasks-with- different-chemical-solutions-vector.html http://www.shutterstock.com/pic-9779923/stock-vector-three-flasks-with- different-chemical-solutions-vector.htmlhttp://www.shutterstock.com/pic-9779923/stock-vector-three-flasks-with- different-chemical-solutions-vector.html [9.] http://www.phmero.hu/ph-mero/ad-11.html http://www.phmero.hu/ph-mero/ad-11.html [10.] http://senselektro.hu/index.php?/M%C3%A9rleg/Analitikai-m%C3%A9rleg/