Enzimvizsgálati módszerek Kitináz aktivitás mérése

Az előadások a következő témára: "Enzimvizsgálati módszerek Kitináz aktivitás mérése"— Előadás másolata:

1 Enzimvizsgálati módszerek Kitináz aktivitás mérése

2 Bevezető A növények folyamatosan ki vannak téve a fertőzés veszélyének, mivel rajtuk vírusok, baktériumok telepednek meg. A növényvédelemben a kutatások egyre inkább a mikrobiológiai megoldások felé fordulnak. Napjainkban ez nagyon fontos lehet, hiszen az új eredményekkel a növényvédő szerek használatát lehetne kiváltani, melyek jelenleg még nagy mértékben terhelik a környezetet.

3 Bevezető A kitin (C8H13O5N)n egy hosszú polimer láncmolekula (poliszacharid), melyet N-acetil-D-glükózamin molekulák alkotnak, ezek a monomerek β (1-4) kötésekkel kapcsolódnak A természetben nagy mennyiségben fordul elő: legismertebb, hogy az ízeltlábúak külső vázát alkotja, de a gombák, baktériumok sejtfalának is egy fő komponense. A kitin acetil-glükózaminná való hidrolízisét két enzim végzi: a kitináz, és a kitobiáz. A kitinázok gyakoriak a természetben, baktériumok, gombák, és növények termelik, és termelődik a kitint tartalmazó táplálékot fogyasztó állatok emésztőmirigyében. A növényekben ez az enzim a mikrobiális fertőzésekre való válaszadóként működik.

4 Kitinázok A kitinázok fontos szerepet játszanak a gombák elleni védekezésben. Ezek hidrolitikus enzimek, ezért képesek hidrolizálni a kitint, amely az egyik legfőbb sejtalkotója nagyon sok növénypatogén gombának. A legújabb kutatások között egyik azon az elven alapult, hogy olyan géneket építenek be növények genetikai állományába melyek kitináz enzimet képeznek. A talajban lévő kitinázaktivitás a talajban lefelé haladva csökken. Jelentős kapcsolatot találtak a kitináz aktivitás, és a nitrogéntartalom között.

5 A módszer alapelve Kitin szuszpenziót tartalmazó talajmintát inkubálnak 16 órán keresztül 37°C-on. A felszabaduló N-acetil-glükózamint KCl-dal választják el, és spektrofotometriás módszerrel határozzák meg.

6 Agyagok és berendezések
centrifuga és centrifugacsövek cellulóz dialízis cső spektrofotométer polipropilén-textil (70 µm finomságú) 100°C-ig állítható vízfürdő Erlenmeyer lombikok (25, 100, 1000 ml) Mérőlombik (50 ml) Papír filter Keverőedény

7 Vegyszerek, oldatok 1. Kitin oldat (5% tömeg/térfogat)
15 g kitint összekeverünk 200 ml tömény HCl-val, és szobahőmérsékleten 3 órán keresztül rázatjuk. A szuszpendált kitint vákuum alatt átszűrjük a polipropilén-textilen. A részecskementes oldatot az éjszaka folyamán vízáramban dializáljuk, majd centrifugáljuk. Ekkor eltávolítjuk a felülúszó folyadékot, és a kitint reszuszpendáljuk desztillált vízben. A dialízist addig ismételjük, míg a kitin-szuszpenzió pH-ja el nem éri az 5.5 – 6-os tartományt. Miután meghatároztuk a száraz tömegét a kitinnek, készítünk egy 5%-os vizes oldatot. Végül a szuszpenziót homogenizáljuk, majd 0,2 g NaN3-ból készített 1000 ml-1 szuszpenziót adunk hozzá. Tárolása 4°C-on.

8 Vegyszerek, oldatok Foszfát puffer (0,12 M pH 6.0)
700 ml desztillált vízben feloldanak g KH2PO4-ot, 0,2 g Na2HPO4*2H2O-ot, és 0.2 g NaN3-ot, NaOH-dal, vagy HCl-dal beállítják a 6-os pH-t, és felhígítják desztillált vízzel 1000 ml-re. Borát puffer (0,8 M pH 9.1) 40 ml 0.8 M-os KOH-ban feloldanak 4.95 g H3BO3-ot, hozzáadnak 20 ml desztillált vizet, a pH-t 9.1-re állítják 0.8 M-os KOH-val, és desztillált vízzel 100 ml-re egészítik ki.

9 Vegyszerek, oldatok KCl oldat (2 M)
700 ml desztillált vízben feloldanak g KCl-ot, és desztillált vízzel 1000 ml-re hígítják. 4-(dimetil-amino)benzo-aldehid törzsoldat (DMBA) 87.5 ml koncentrált ecetsav és 12.5 ml koncentrál HCl elegyében feloldanak 10 g DMBA-et. 4°C-on tárolják.

10 Vegyszerek, oldatok Higított DMBA oldat
1:4 arányban vegyítenek DMBA törzsoldatot koncentrált ecetsavval. Minden nap új oldat elkészítése szükséges. N-acetil-glükózamin standard oldat (45 mM) 30 ml desztillált vízben feloldanak 0.5 g N-acetil-glükózamint, majd felhigítják 50 ml-re. Minden nap új oldat elkészítése szükséges.

11 Eljárás Erlenmeyer lombikba teszünk 1.0 g nedves talajmintát, hozzáadunk 5 ml foszfát puffert. 5 ml kitinszubsztrát oldat hozzáadása után a lombikot gumikupakkal lezárjuk, és 16 órán át 37°C-on inkubáljuk. Felügyelet alatt a szubsztrátoldatot rögtön az inkubálási periódus végén adjuk hozzá. Az inkubálás után 10 ml KCl oldatot teszünk hozzá, majd szobahőmérsékleten 30 percig rázatjuk. Ezt követi a szuszpenzió szűrése. A szűrlet 0.5 ml-éhez 1.5 ml desztillált vizet, 0.4 ml borát puffert adunk, és 3 percig vízfürdőben forraljuk. Szobahőmérsékletűre hűtjük 5 ml higított DMBA oldattal alaposan elkeverjük, és 30 percig 35°C-on inkubáljuk. Az optikai sűrűséget 20 percen belül 585 nm-en mérjük. Minden értékelésről legalább egy másolatot készítünk.

12 Kalibrációs görbe Négy mérőlombikba 12.5 ml foszfát puffert, 25 ml KCl oldatot, N-acetil-glükózaminból pedig pipettával bemérjük a következő mennyiségeket: 0, 0.5, 1.0 és 2.5 ml. Desztillált vízzel felhigítjuk őket 50 ml-re. Mindegyik oldatból 0.5 ml-t pipettázunk kémcsőbe, és a fent említettek szerint végezzük ez az N-acetil-glükózamin vizsgálatát. A N-acetil-glükózamin koncentrációk a kalibrációs görbén a következők: 0, 50, 100, 150, 200 és 250 µg ml-1.

13 Számítás Pontosítsuk az adatokat a vak mintára, és a következőképpen számoljunk: N-acetil-glükózamin (µg g dwt ) = C: a mért N-acetil-glükózamin koncentráció (µg/ml) V: a végtérfogat, amit a talajmintához adunk (20 ml) dwt: a száraz tömege 1 g nedves talajmintának (dry weight of 1 g moist soil) C x v dwt

14 Forrás Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 - kép