Enzimaktivitási módszerek: celluláz-aktivitás mérése

Az előadások a következő témára: "Enzimaktivitási módszerek: celluláz-aktivitás mérése"— Előadás másolata:

1 Enzimaktivitási módszerek: celluláz-aktivitás mérése

2 Enzimek a talajban Enzimek: biológiai folyamatokat katalizáló biomolekulák Enzimek nevezéktana: hagyományosan az általuk lebontott vagy felépített vegyület neve -áz végződéssel; újabban azonban új nevezéktan készült, amely pontosabban kategorizálja őket a katalizált reakció típusa alapján Elhelyezkedésük a talajban: élő vagy elhalt sejtek, sejttöredékek citoplazmájában vagy azok külső felületéhez kötődve, vagy sejten kívül mint oldott molekula, vagy agyagásványokhoz adszorbeálódva, vagy kolloid rendszerekben

3 Enzimek mennyiségének mérése a talajban
Mintavétel A méréshez meg kell akadályozni, hogy a mintavétel után a mintában további enzim- vagy a reakciótermékek fogyása játszódjon le A leggyakrabban toluolt adnak a mintához, így a lebontó mikrobák ezt bontják és nem a talajba került enzimet; segíti a sejten belüli enzimek kibocsátását is A talaj sterilizálásához nagy energiájú elektron-nyalábokat vagy gammasugárzást használnak: így ki lehet szűrni az élő sejtek által folyamatosan végzett enzimtermelést Analitikai elemzés

4 Mérési eredmények kiértékelése
Nem lehet megkülönböztetni kísérleti úton, hogy a minta enzimtartalmának mekkora része milyen módon volt kötve Nem a tényleges talajban lévő enzim-aktivitást mutatja meg, inkább egy potenciális maximumot: a valós aktivitást a szubsztrát pH-tól és hőmérséklettől függő koncentrációja befolyásolja Mindezen hibákkal azonban a többi mikrobiológiai elemzési módszer is rendelkezik, ezzel viszont mennyiségi meghatározás is végezhető és jól kombinálható más módszerekkel

5 Cellulóz és celluláz I. Cellulóz: növényi sejtfalak alkotóeleme, egy D-glükózból β (1-4) glikozidos kötéssel képződött polimer, vízben oldhatatlan A természetben nagy mennyiségben fordul elő, így bontása létfontosságú Cellulóz bontása a celluláz enzimmel történik: ez 3 enzimből áll: az exo- β-1,4-glükanáz a kristályos cellulózt, az endo- β-1,4-glükanáz a nem-kristályos cellulózt hasítja oligoszacharidokká, a β-glükozidáz pedig ezeket bontja egyszerű glükózzá A bontás lassú, az avar típusától, a szubsztrát- és vízkoncentrációtól, pH-tól, hőmérséklettől erősen függ

6 Cellulóz és celluláz II.
A talajba kijutva celluláz enzimei más-más elhalt növényi alkotóelemeken adszorbeálódnak és eltérő ütemben szabadulnak fel Bontás optimuma: pH=5-6, °C Főleg a rhizoszómában zajlik Talajszárítás erősen visszaveti a folyamatot A talajban lévő cellulázt nagyrész gombák termelik (Actinomyces képes megélni csak cellulózon mint szénforrás, anaerob körülmények között Clostridium) Celluláz-aktivitás mérése a talajban a szubsztrát talajmintához adagolás hatására felszabaduló glükóz és szén-dioxid mennyisége alapján történik Szubsztrát: gyapot-szálak, nyomjelzett cellulóz, karboxi-metil cellulóz (CMC), Avicel (savval részben hidrolizált mikrokristályos cellulóz)

7 Schinner és Von Mersi módszere (1990.)
Segédanyagok: 2 M, pH 5,5 acetát-pufferoldat, 0,7% Na-CMC sóoldat, a cukor meghatározásához 4 féle reagens: A: Vízmentes Na2CO3 és KCN keverékének vizes oldata B: Kálium-vas-hexacianid vizes oldata C: Vas-ammónium-szulfát, nátrium-dodecil-szulfát és kénsav keverékének vizes oldata glükóz-monohidrát oldat Mérés menete: 10 g szántóföldi vagy 5 g erdei talajmintát (2 mm vízzel nedvesítve), 15 ml puffert és 15 ml CMC-oldatot kevertek egy Erlenmayer-lombikban, majd lefedve inkubálták 50 °C-on 24 órát Belső standardnak 15 ml CMC-t kevertek hozzá szűrés előtt, majd leszűrték, a szűrletet hígítva mintát vettek 1-1 ml A, B reagenst hozzáadva 15 percet forralták 100 °C-on, majd 5 perc 20°C-os hűtőfürdő után C reagensből adtak hozzá 5 ml-t és egy órát állni hagyták 20°C-on Megmérték a fényáteresztő-képességét 690 nm-en

8 Az oldatok részletes receptje
Ecetsavas puffer: 164,08 g nátrium-acetátot oldottak 700 ml desztillált vízben, 5,5-re állították a pH-t ecetsavval és 1000 ml-re hígították 0,7 %-os CMC-só-oldat: 7 g CMC-t oldottak 1000 ml ecetsavas pufferben és 2 órára 45 oC-on inkubálták, 4 oC-on egy hétig tárolható A reagens: 16 g vízmentes Na2CO3-ot és 0,9 g KCN-ot oldottak 1000 ml desztillált vízben B reagens: 0,5 g kálium-vas-hexacianidot oldottak 1000 ml desztillált vízben; barna üvegekben tartandó! C reagens: 1,5 g vas-ammónium-szulfátból, 1 g nátrium-dodecil-szulfátból és 4,2 ml cc. kénsavból 50 oC-on desztillált vizes oldatot készítettek és 1000 ml-re hígították glükóz-monohidrát oldat: 28 mg glükóz-monohidrátot oldottak 1000 ml desztillált vízben

9 A módszerről levont következtetések
Csak az endoglükanáz és a β-glükozidáz mennyisége mérhető így, az exoglükanázé nem A módszer főleg a nedves erdőtalajok mérésére adott jó eredményt A bomlás sebessége az időtől nem lineárisan függ A bontást zavaró más vegyületek: nagy koncentrációban jelenlévő sók, ezüst, ammónium-ion, oxalátok stb. , a talaj egyéb mikrobiális paraméterei viszont nem befolyásolják Toluolos kezelés nem változtatta meg az eredményt számottevően A pH kontrollja fontos: A és B oldatok hozzáadása után pH>10,5, C oldat hozzáadása után pH<2 legyen A cianid alkalmazása kiváltható hidrogén-peroxidos, savas közegben történő oxidációval

10 Hope és Burns módszere (1987.)
Segédanyagok: azidos, 0,1 M, pH 5,5 acetát-pufferoldat, Avicel (por), a cukor meghatározására 7 féle reagens: I. oldat: Na és K borkősavval alkotott sója, Na2CO3 és NaHCO3 vizes oldata II. oldat: Na2SO4 vizes oldata III. oldat: az első kettő keveréke IV. oldat: CuSO4*5H2O és Na2SO4 vizes oldata V. oldat: a III. és a IV. keveréke glükóz-monohidrát oldat arzenát-molibdát oldat Mérés menete: Erlenmeyer-lombikba mértek 1 g nedves talajt, 5 ml acetát-puffert és 0,5 g Avicelt, lezárva 16 órát inkubálták 40°c-on, majd belső standardnak Avicelt hozzáadva, centrifugálták. 1 ml mintát véve, azt 1 ml V. oldattal 20 percet forralva, majd lehűtve és 1 ml arzenát-molibdát oldatot, majd 3 ml desztillált vizet hozzáadva megmérték a fényáteresztő-képességét 520 nm-en.

11 Az oldatok részletes receptje
Azidos acetát-puffer: 13,6 g nátrium-acetát-tetrahidrátot oldottak 700 ml desztillált vízben, majd a pH-t 5,5-re állították ecetsavval. Hoozáadtak 2 g nátrium-azidot és 1000 ml-re hígították az egészet. I. oldat: 15 g-ot Na és K borkősavval alkotott sójából, 30 g Na2CO3-ból 300 ml desztillált vízben oldatot készítettek, és ebben 20 g NaHCO3-ot oldottak fel II. oldat: 180 g Na2SO4 oldata 500 ml desztillált vízben; kiforralták belőle az oldott oxigént, majd hagyták lehűlni III. oldat: az első kettő keveréke 1000 ml-re hígítva IV. oldat: 5 g CuSO4*5H2O és 45 g Na2SO4 oldata 250 ml desztillált vízben V. oldat: a III. és a IV. 1:1 arányú keveréke (frissen keverték) glükóz-monohidrát oldat: 79 mg glükóz-monohidrátot oldottak 1000 ml desztillált vízben arzenát-molibdát oldat: 25 g ammónium-molibdátot oldottak 450 ml desztillált vízben és 21 ml cc. kénsavat adtak hozzá kevergetés mellett. 25 ml NA2HAsO4 * 7 H2O oldatot adtak hozzá (3 g só 25 ml vízben). 2 nap 37 oC-on történő állás után barna üvegekbe töltötték. Használat előtt egy egységnyi ilyen oldattal 2 egységnyi 0,75 M kénsavat kevertek.

12 A módszerről levont következtetések
Az enzimreakció lineáris volt 16 órán keresztül Az azid inhibitorként működött: megakadályozta a keletkezett cukrok baktériumok általi elfogyasztását, de hatását minden talajtípusnál külön ellenőrizni kell, mert nem univerzális A módszer nem különbözteti meg a különböző celluláz-enzimeket Magas glükóz-oxidáz koncentráció a talajban meghamisítja ennek a mérési módszernek az eredményét

13 Alternatív módszerek A szubsztrátként szolgáló cellulóz lehet szűrőpapír, cellubióz, HEC (hidroxi-etilcellulóz) stb. is; lehet oldott (Avicel) vagy oldahtatatlan (szűrőpapír) formában a mérés során Citromsavas pufferoldatokat is szokás alkalmazni A keletkezett cukor mennyisége dinitroszalicilsav alkalmazásával is megbecsülhető Az egyes mikroba-fajok egész celluláz enzimrendszerekkel rendelkeznek, amelyekben az említett 3 enzim működését más enzimek is segítik; ezekre is vannak mérési módszerek Az egész téma, mind a talaj celluláz-aktivitásának megmérése, mind a celluláz-enzimrendszer működése és a talajban történő cellulóz-lebontás sebessége erősen kutatott téma, ahol még sok megoldandó problémával néznek szembe a kutatók.

14 Források Methods in Applied Soil Miccrobiology and Biochemistry, Chapter 7: Enzime activities (a bevezető: oldal és K. Alef és P. Nannipieri cikke a oldalon) (1995, Academic Press Ltd.) Az Avicelről: T. K. GHOSE (INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY): MEASUREMENT OF CELLULASE ACTIVITIES Kép forrása: