Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás

Az előadások a következő témára: "Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás"— Előadás másolata:

1 Nukleinsavak kimutatása, szekvenálás

2 A nukleinsav kimutatás
etidiumbromid 3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromid lg= nm le=590 nm Br - X= O: YOYO-1 X= S: TOTO-1

3 A C A C G Rövidítések bázis A G C T P OH cukorrész
3’ 3’ 5’ 5’ cukorrész A C P 3’ 5’ G OH foszfodiészter kötés pApCpG [ACG]

4 A C A C G Rövidítések bázis A G C T cukorrész P OH
3’ 3’ 5’ 5’ foszfodiészter kötés A C P 3’ 5’ G OH pApCpG [ACG]

5 Szekvencia meghatározása
1. Fragmentálás restrikciós enzimekkel (W. Arber, H. Smith, D. Nathans) törzs 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAGC 5’ EcoRI E.coli Cél: feldarabolás 5’ GGCC 3’ 3’ CCGG 5’ Hae III Néhány II-es tipusú restrikciós enzim (>2000) Bam HI G/GATCC Bacillus amyloliquefaciensH Bst I Bacillus stearothermophilus1503-4R Eco RI G/AATTC Escherichia coli RY 13 Fok I GGATGN9/ CCTACN13/ Flavobacterium okeanokoites Hind II GTPy/PuAC Haemophilus influenzae Rd Hind I A/AGCTT Hpa II C/CGG Haemophilus parainfluenzae Msp I Moraxella spezies Not I GC/GGCCGC Nocardia otitidiscaviarum Sac I GAGC/TC Streptomyces achromogenes Sau 3A /GATC Staphyllococcus aureus 3A Sma I CCC/GGG Serratia marcecescens Sb Xma I C/CCGGG Xanthomonas malvacearum

6

7 2a. Kémiai módosítás/hasítás (A. Maxam, W.Gilbert, 1977)
1. lépés Homogén „Single-stranded” DNS minta előállítása 5’ATTGACTTAGCC3’ Jelölés 5’-végen 32P (*) (polinukleotid kináz) 2. lépés *ATTGACTTAGCC mer 3. lépés Kémiai hasítás G reakció C reakció A reakció + G reakció T reakció + C reakció *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATT *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATTGACTT *ATTG *ATT *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGACT *ATTGAC *ATTGA *AT *A *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGA 4. lépés: elektroforézis 5. lépés: autoradiográfia 6. lépés: szekvencia leolvasás

8

9 Kémiai hasítás: Purinok G reakció
5’ 3’ 7 5’ 3’ + OH - Dimetilszulfát 5’ 3’ + piperidin 5’ b a 3’ 3’ OH - 5’

10 A > G: A reakció + 3 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ OH - 3’ 5’ 3’ Dimetilszulfát
0 oC, 0,1 M HCl 2 óra pH oC 5’ 3’ + OH - 3’ 5’

11 Kémiai hasítás: Pirimidinek
5’ 5’ 3’ timin 3’ citozin hidrazin 3 3 Urea 2 1 4-Me-3-pirazolon + 3-amino-pirazol 2-dezoxiribozil-hidrazon piperidin 3’ Hasítás a 3’ végen

12 A. C + T: T reakció 3’ 5’ 3’ 5’ hidrazin 3’ 5’ 3’ 5’ piridin OH - 3’

13 B. C reakció + + + 5’ 5’ hidrazin 1 M NaCl 3’ 3’ piridin 5’ 5’ 3’ 3’
OH - + 5’ 3’ 3’ 3’

14 Példa: G hasítás után 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 *ATTGAACTTAGCC
Fragmens hossz 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 *ATTGAACTTAGCC Elektroforézis *ATTGAACTTA AACTTAGCC AACTTA *ATT CC + + Színezékkel festett (minden csik) Autoradiográfiás módszerrel jelzett gél („izotóp” csik)

15 Maxam-Gilbert módszer - kiértékelés

16 2b. Didezoxi beépítés-enzimes módszer (F. Sanger et al., 1977)

17 2b.1 Didezoxi nukleotid jelölése Radioaktív izotóp (32P) 32P
Fluorofór (fluoreszcens jelölés, L. E. Hood, 1986)

18 DNS polimeráz I dATP, dTTP, dCTP, dGTP + didezoxi analóg (ddATP)
2b.2 A DNS-polimeráz müködésének blokkolása szekvenálandó DNS 3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAA primer DNS polimeráz I dATP, dTTP, dCTP, dGTP + didezoxi analóg (ddATP) 3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAAGCGATTA 4 edény 4 analóg + 3’ GAATTCGCTAATGC 5’ CTTAAGCGA

19 2b.3 Gélelektroforézis Leolvasás - komplement szál

20 DENATURÁLÁS ELEKTROFORÉZIS AUTORADIOGRÁFIA
5’ 3’ DNS polimeráz ddTTP ddCTP ddGTP ddATP (32P) DENATURÁLÁS ELEKTROFORÉZIS AUTORADIOGRÁFIA T C G A