A RECEPTOR KERESZTKÖTÉSE JELÁTVITELI MECHANIZMUSOKAT INDÍT BE

Az előadások a következő témára: "A RECEPTOR KERESZTKÖTÉSE JELÁTVITELI MECHANIZMUSOKAT INDÍT BE"— Előadás másolata:

1 A RECEPTOR KERESZTKÖTÉSE JELÁTVITELI MECHANIZMUSOKAT INDÍT BE
ligand kináz aktiváció foszforiláció adaptorok toborzása JEL Gén átírás Transzkripciós faktorok aktiválása

2 THE IgM B-CELL RECEPTOR
a a THE IgM B-CELL RECEPTOR antigen binding mIg molecule H L V b a Ig-a/Ig-b heterodimer Signal transduction Lyn Kinases Syk Btk SHP-1 Phosphatases SLP-65/BLNK PLC HS1 Vav Adaptors + substrates

3 A B-SEJT RECEPTOR FELÉPÍTÉSE
Ig-a/CD79a a b Y Ig-b/CD79b Ig domén + CHO ITAM ITAM: YxxL x7 YxxI ITAM: Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif

4 B-SEJT RECEPTOR SZIGNÁLÚTVONAL
1. kereztkötés Ag Lyn 2. Src-family kináz activáció P és ITAM foszforiláció 3. Syk toborzás és aktiváció Syk 4. SLP foszforiláció + Ca felszabadulás SLP P Kalcium felszabadulás P = ITAM

5 A LIMFOCITA AKTIVÁCIÓ KINETIKÁJA
ANTIGEN SIGNAL1. Nyugvó limfocita G0 proliferáció DNS szintézis Effektor sejt Memóris sejt Transzport Membrán változások RNS és fehérje szintézis Ko-receptor Adhéziós molekulák Citokinek 2. jel Nyugvó limfocita G0 PTK aktiváció RNS szintézis szabad Ca Fehérje szintézis fehérje foszforiláció DNS szintézis Limfoblaszt 0 10sec 1min 5min hr hrs hrs hrs

6 AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE

7 AZ ELLENANYAGOK SZERKEZETE
Nehéz lánc (H) VH VL CH Könnyű lánc (L) CL KOMPLEMENT AKTIVÁCIÓ SEJTHEZ KÖTŐDÉS LEBOMLÁS TRANSZPORT

8 AZ ELLENANYAG SOKFÉLESÉG GENETIKAI HÁTTERE
VL VH S – S S – S A sokféleség kialakulásának mechanizmusa? Más szabályok a variábilis és konstans régiók kialakulására? Szimmetrikus molekula  két azonos VH és VL  mindkét kromoszóma ugyanazt a szekvenciát kódolja?

9 AZ IMMUNOGLOBULINOK JELLEGZETES AMINOSAV SZERKEZETE
Mieloma multiplex Plazmasejt tumorok – tumorsejtek a csontvelőben Monoklonális eredetű emberi immunoglobulinok a szérumban (50-100mg/ml) Rodney Porter és Gerald Edelman 1959 – 1960 fehérje tisztítás AZ IMMUNOGLOBULINOK JELLEGZETES AMINOSAV SZERKEZETE Gél elektroforézis Redukció L H 50 kDa Nehéz lánc 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 25 kDa Könnyű lánc Variábilis Constans

10 A könnyű lánc egyes részei variábilisak, mások konzerváltabbak:
Hipervariábilis és framework régiók

11 V C V2 C V3 V1 A MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI DOGMÁJA
Gén Protein 1 GÉN = 1 FEHÉRJE A MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI DOGMÁJA AZ IMMUNOGLOBULIN SZEKVENCIA JELLEGZETESSÉGE ELMÉLETEK 1 GÉN magas szomatikus mutációs ráta a V régióban V C Sok GÉN ( – ) V2 C V3 V1

12 AZ IMMUNOGLOBULINOK MOLEKULÁRIS GENETIKÁJA
Hogyan magyarázható az ellenanyagok kettős funkciója? Dreyer & Bennett feltételezése (1965) Egy adott izotípusú ellenanyag valószínűleg: Az egyetlen C régiót kódoló gén a csíravonalban el van választva a V régió génektől A V génekből többféle áll rendelkezésre Feltételezhető egy mechanizmus, amely a V és C géneket fúzionálja egy teljes immunoglobulin génné A feltételezés ellentétben állt az akkor elfogadott nézettel, amennyiben a DNS (genetikai állomány) egy adott egyed minden sejtjében azonos

13 A Dreyer - Bennett hipotézis igazolása
C A csíravonalban egyetlen C gén van (L-lánc), amely a sok V géntől távol helyezkedik V A B-sejtekben a V és C géneket valamilyen mechanizmus egy teljes immunoglobulin génné fúzionálja C V V Módszer a sok V gén létezésének és a V – C gén átrendeződés igazolására

14 Módszer C V Csíravonal DNS C V Átrendezett DNS Megközelítés:
Specifikus cDNS próbák a különböző V régiók és a C régiók elkülönítéséhez DNS restrikciós enzimek a DNS fragmentáláshoz A csíravonalnak (pl. méhlepény) és az érett B-sejteknek (pl. plazmocitóma/mielóma) a DNS-ei eltérőek

15 Susumi Tonegawa kísérlete 1975 Restrikciós enzim hasítás
DNS-kivonás Restrikciós enzim hasítás Gél elektroforézis Hibridizáció VC Kb 6,0 1,5 V-próba 4,0 C V C-próba B-sejt Méhlepény 6.0 Kb V C 4.0 Kb 1.5. Kb V C B-sejt

16 The actual Tonegawa experiment
1. DNS BamHI emésztés 2. Elektroforézis 3. Gélszeletek készítése (MW Szerint) 4. DNS extrakció 5. Hibridizáció 125I-jelölt Kappa lánc RNS-sel 6. RNAse kezelés. (DNS-RNS hibrid RNAse rezisztens 7. Precipitáció (DNS-RNS hibrid igen a nem kötődött próba nem) 8. Radioaktivitás mérése

17 Sok variábilis gén van, de csak egy konstans gén
KÖVETKEZTETÉS Sok variábilis gén van, de csak egy konstans gén V C CSÍRAVONAL A V és C gének csak a B-sejtekben kerülnek egymás mellé C V B-SEJT GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE EGY GÉNNÉ Fehérje Gén

18 Az Ig gének szekvenálása tovább bonyolította a képet
A csíravonal VL gének szerkezete hasonló volt a Vk és and Vl könnyű láncok esetében A csíravonal és az átrendezett DNS nem volt azonos CL VL ~ 95as ~ 100as L CL VL ~ 95as ~ 100as JL Az aminosavak egy része a kis számú J (Joining) régiókból származik L CL VL ~ 208as L Honnan származik a 13 extra aminosav?

19 Az Ig H lánc további sokféleséggel jellemezhető
VH DH JH CH A nehéz lánc a JH és CH gének közötti szakaszon további (0 – 8) aminosavat tartalmaz Ezek a D (DIVERSITY) régióból származnak A nehéz lánc kialakulásához 2 rekombinációs folyamatra van szükség JH to DH , VH to JHDH VL JL CL L A könnyű lánc kialakulásához 1 rekombinációs folyamatra van szükség : VL to JL

20 AZ IMMUNOGLOBULIN POLIPEPTID LÁNCOKAT TÖBB GÉN SZEGMENS KÓDOLJA
AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK ELRENDEZŐDÉSE 2 kromoszóma kappa könnyű lánc gén szegmensek 22 kromoszóma lambda könnyű lánc gén szegmensek 14 kromoszóma nehéz lánc gén szegmensek AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK SZÁMA Variábilis (V) Diverzitás (D) Kapcsoló (J) Gén szegmens Könnyű lánc Nehéz lánc kappa lambda

21 A KAPPA (κ) LÁNC GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE
Jκ Vκ B-sejt2 40 Vκ 5 Jκ Vκ Jκ Csíravonal B-limfocita fejlődés során Jk Jκ Vκ B-sejt1 DNS

22 A K-LÁNC KIFEJEZŐDÉSE VκJκ Vκ Cκ J Cκ J Vκ Cκ J Vκ Cκ J Vκ pA P E E
Primer RNS átirat Cκ E J Vκ mRNA Cκ J Vκ AAAA Transzláció Cκ J Vκ Fehérje

23 A VH GÉN SZEGMENSEK SZOMATIKUS ÁTRENDEZŐDÉSE
6 JH VH VH VH D D D D JH JH JH JH A B sejt fejlődés során JH JH D VH JH JH D VH

24 AZ ANTIGÉN RECEPTOROK SOKFÉLESÉGE
VH D JH VL JL V-Domének C-Domének VH-D-JH VL-JL

25 AZ IMMUNOGLOBULIN GÉN SZEGMENSEK ÁTRENDEZŐDÉSÉNEK SORRENDJE
D – J rekombináció V – DJ rekombináció VDJ – δ transzkripció δ transzláció Pót könnyű lánc V – J rekombináció VJ –  (vagy VJ - ) transzkripció  vagy  transzláció B-sejt mIgD mIgM

26 A kombinációs sokféleség becslése
A funkcionális V, D és J gének száma: 65 VH x 27 DH x 6JH = 10, 530 kombináció 40 Vk x 5 Jk = 200 kombináció 30 Vl x 4 Jl = 120 kombináció = 320 különböző könnyű lánc Amennyiben a H és L láncok véletlenszerűen párosodnak mint H2L2 19,440 x 265 = 3,369,600 lehetőség Csak a KOMBINÁCIÓS sokféleség A valóságban bizonyos H + L kombinációk nem fordulnak elő, mert instabilak Bizonyos V és J gének gyakrabban fejeződnek ki, mint mások A KAPCSOLÁSI sokféleség tovább növeli a szekvenciák számát A POTENCIÁLIS B-SEJT KÉSZLET KIALAKULÁSA

27 A SZOMATIKUS GÉN ÁTRENDEZŐDÉS EREDMÉNYE
A gén szegmensek kombinációja nagy számú, eltérő variábilis régióval rendelkező nehéz (H) és könnyű (L) láncot eredményez, amelyek egy adott egyedben a különböző B-sejt klónokban fejeződnek ki Az egyik kromoszómán létrejött sikeres gén átrendeződés gátolja a gén átrendeződést a másik kromoszómán ALLÉL KIZÁRÁS 3. Egy B-sejt csak egy típusú nehéz (H) és egy típusú könnyű (L) láncot termel ELKÖTELEZŐDIK EGY TÍPUSÚ ANTIGÉN KÖTŐHELY LÉTREHOZÁSÁRA 4. A teljes B sejt készlet különbözőképpen átrendezett immunoglobulin gének termékeit kifejező egyedi B-sejtekből áll

28 A sikeres génátrendeződés gátolja a rekombinációt a másik kromoszómán
A B-SEJT ANTIGÉN FELISMERŐ RECEPTOR ÉS AZ ELLENANYAGOK SOKFÉLESÉGÉT MEGHATÁROZÓ GENETIKAI MECHANIZMUSOK Szomatikus génátrendeződés A variábilis domének kialakulása a VJ (L-lánc) és a VDJ (H-lánc) gének rekombinációjával Hogyan képes a B sejt csak egyfajta könnyű és egyfajta nehéz láncot kifejezni? Annak ellenére, hogy minden B sejtben egy apai és egy anyai Ig lókusz is jelen van A gének nagy része ko-dominánsan kifejeződik Hogyan történik a B sejtekben az egyik allél aktiválása és a másik gátlása? ALLÉL KIZÁRÁS A sikeres génátrendeződés gátolja a rekombinációt a másik kromoszómán Csak egyféle H- és L-lánc szintetizálódik A sejtfelszínre 2 H- és 2 L-láncból álló dimerek kerülnek ki AZ ANTIGÉN JELENLÉTÉTŐL FÜGGETLEN FOLYAMATOK A B-SEJT ÉRÉS SORÁN A CSONTVELŐBEN MENNEK VÉGBE

29 How does somatic gene rearrangement
(recombination) work? How is an infinite diversity of specificity generated from finite amounts of DNA? Combinatorial diversity 2. How do V region find J regions and why don’t they join to C regions? rule -Special - Recobnitation Signal Sequences (RSS) - Recognized by Recombination Activation Gene coded proteins (RAGs) PALINDROMIC SEQUENCES HEPTAMER CACAGTG CACAGTG GTGACAC GTGACAC NONAMER ACAAAAACC GGTTTTTGT TGTTTTTGG CCAAAAACA

30 Somatic recombination to generate
antibody diversity Immunoglobulin genes are composed of separated segments of DNA that become joined together by a process called somatic recombination to make a functional gene. In heavy chain genes there are three gene segments, the variable or V segment, a diversity or D gene segment, and the joining or J segment. Light chain genes, such as those shown here, have only two gene segments - the V and the J segments. Gene segments that can be recombined have specific sequence motifs adjacent to them, called recombination signal sequence, or RSS motifs. A protein complex containing the products of the recombination activator genes, RAG1 and RAG2, binds specifically to the RSS motifs, in this example flanking a V gene segment and a J gene segment. The individual gene segments, to whose flanking RSS motifs the RAG protein complexes bind, are selected at random from a number of copies present at each gene locus. The Rag protein complexes bring together the gene segments to be recombined, and cleave the DNA exactly at the junction of the gene segment and it's adjoining RSS motif. The cleavage creates a hairpin of DNA at the ends of the gene segments and double stranded breaks at the ends of the RSS motifs. Additional proteins, DNA-dependent protein kinase, Ku, Artemis and a dimer of DNA ligase and XRCC4, are incorporated into a large complex with the RAG proteins. These RSS ends are joined, forming what is called the "signal joint", to create a closed circle of DNA that plays no further role in the recombination process. The DNA hairpins at the ends of the gene segments are then cleaved. An additional enzyme, terminal deoxynucleotidyl transferase or TdT, is recruited and adds additional nucleotides to the ends of the DNA strands The other enzymes in the complex ligate together the two ends of the gene segments, completing the recombination process.

31 Omen syndrome RAG deficiency
Súlyos kombinált immundrficiencia Severe combined immunodeficiency syndrome (SCID). SCID is characterized by a lack of functional T cells and B cells and the inability to make an adaptive immune response. Infants with SCID typically show infections with opportunistic pathogens. Panel a shows chronic Candida albicans infection in the mouth of an infant with SCID. SCID can be caused by various genetic defects, one of which is complete loss of RAG function. Panel b shows an infant with Omenn syndrome, a similar immunodeficiency which is due to a genetic defect that results in 80% loss of RAG activity. The bright red rash on the face and shoulders, which is due to chronic inflammation, is a characteristic of this condition. Unless an immune system can be reconstituted by bone marrow transplantation from a healthy donor, babies with SCID or Omenn syndrome die in infancy. Panel a courtesy of Fred Rosen; panel b courtesy of Luigi Notarangelo. Omen syndrome RAG deficiency Korai manifesztáció Erős hasmenés Vörös foltok a testen Opportunista fertőzések (Candida albicans, Pneumocystis carnii pneumonia) Nyirokcsompk nem tapinthatók

32 V, D, J flanking sequences
Sequencing upstream and downstream of V, D and J elements revealed conserved sequences of 7, 23, 9 and 12 nucleotides in an arrangement that depended upon the locus Vl 7 23 9 Jl 7 12 9 Vk 7 12 9 Jk 7 23 9 D 7 12 9 VH 7 23 9 JH

33 Recombination signal sequences (RSS)
HEPTAMER - Always contiguous with coding sequence NONAMER - Separated from the heptamer by a 12 or 23 nucleotide spacer VH 7 23 9 D 12 JH   VH 7 23 9 D 12 JH 12-23 RULE – A gene segment flanked by a 23mer RSS can only be linked to a segment flanked by a 12mer RSS

34 A 12-23 szabály molekuláris háttere
23-mer = two turns 12-mer = one turn Intervening DNA of any length 23 V 9 7 12 D J 7 9

35 Molecular explanation of the 12-23 rule
V1 D J V2 V3 V4 V8 V7 V6 V5 V9 V1 V2 V3 V4 Loop of intervening DNA is excised V8 V7 V6 V5 Heptamers and nonamers align back-to-back The shape generated by the RSS’s acts as a target for recombinases 7 9 23-mer 12-mer V9 D J An appropriate shape can not be formed if two 23-mer flanked elements attempted to join (i.e. the rule)

36 V1 D J 9 7 CONSEQUENCES OF RECOMBINATION Generation of P-nucleotides
23-mer 12-mer

37 V1 D J 9 7 Generation of N-nucleotides V4 V5
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Loop of intervening DNA is excised 7 9 23-mer 12-mer

38 A TdT enzim a CD3 régióba illeszt extra-nuklleotid szekvenciákat

39 Az IgD and IgM típusú B-sejt receptor egyidejű expresszióját alternatív splicing és polyadeniláció teszi lehetővé In mature B cells, transcription initiated at the VH promoter extends through both the Cμ and Cδ genes. For simplicity we have not shown all the individual C-gene exons but only those of relevance to the production of IgM and IgD. The long primary transcript is then processed by cleavage, polyadenylation, and splicing. Cleavage and polyadenylation at the μ site (pAμm; the 'm' denotes that this site produces membrane-bound IgM) and splicing between Cμ exons yields an mRNA encoding the μ heavy chain (left panel). Cleavage and polyadenylation at the δ site (pAδm) and a different pattern of splicing that removes the Cμ exons yields mRNA encoding the δ heavy chain (right panel). AAA designates the poly A tail. MC, exons that encode the transmembrane region of the heavy chain.

40 How does somatic gene rearrangement
(recombination) work? How is an infinite diversity of specificity generated from finite amounts of DNA? Combinatorial diversity 2. How do V region find J regions and why don’t they join to C regions? rule How does the DNA break and rejoin? Imprecisely, with the random removal and addition of nucleotides to generate sequence diversity Junctional diversity (P- and N- nucleotides, see above)

41 AZ IMMUNOGLOBULIN SZINTÉZIS FOLYAMATA
Szekretált Ig Membrán Ig Golgi ER A H és L láncok külön riboszómákon szintetizálódnak Leader szekvencia Riboszóma mRNS

42 A B-sejtek fejlődésé a csontvelőben

43 A B-sejt fejlődés során két ponton történik a génátrendeződés
Minőségének ellenőrzése

44 The pre B-cell receptor monitors the quality of heavy chain rearrangement
Mutation in λ5– arrest at Pro-B cell stage SEVERE IMMUNODEFICIENCY Productive µ-chain rearrangement ---assembles pre-BCR Switches off RAG genes, enzymes No further µ-chain rearrangement ALLELIC EXCLUSION Only one specificity

45 A génátrendetődés sorrendje, kinetikája a B-sejt fejlődés során

46 Y A B sejt fejlődés szakaszai Nagy pre-B sejt Pre-receptor
Őssejt - HSC Korai pro-B sejt Késői pro-B sejt Csíravonal DH to JH VH to DHJH VHDHJH Perifériás érett B sejt Kis pre-B sejt Éretlen B sejt Y Receptor H+L Az egyes érési fázisokat sejtfelszíni markerek megjelenése (vagy eltűnése) jellemzi

47 Az autoreaktív receptorral rendelkező B-sejtek a csontvelőben maradnak
A B-sejtek begatív szelekciója

48 A self-reaktív klónokban újra aktiválódik a RAG enzim és a könnyű lánc
átrendeződése folytatódik (receptor editing) addig amíg megszűnik a self reaktivitás Binding to a self antigen in the bone marrow causes the immature B cell to continue to rearrange its light-chain locus. This deletes the existing self-reactive rearrangement and may also produce a new light-chain rearrangement giving immunoglobulin that is not specific for self antigen. Successive rearrangements occur until either a new non-self-reactive rearrangement is made, and the B-cell continues its development (right panels), or no more rearrangements are possible and the B cell dies (left panels).

49 Ezek az éretleb anergiás sejtek a periférián hamar elpusztulnak
Az oldható saját antigénnel reagáló B sejtek (monovalens kötés a sejtfelszíni IgM-hez) funkcionálisan inaktív állapotot (anergiát ) indukál. Ezek az éretleb anergiás sejtek a periférián hamar elpusztulnak IgM monovalens kötés