Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2

Az előadások a következő témára: "Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2"— Előadás másolata:

1 Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2
Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (2.) Az elsődleges antigén-ellenanyg kapcsolódáson alapuló immunológiai módszerek (ELISA) MHC tipizálás Hiperszenzitivitási reakciók (a diasorhoz tartoznak a FIG4(T-APC).MPG (998KB) és a pro5.exe (4414KB) animációkat tartalmazó fájlok)

2 Az immunoesszék érzékenysége

3 A T- és B-limfociták funkcionális aktivitásának mérése
Témák: A T- és B-sejtek poliklonális aktivációja a TCR vagy a BCR nem antigén-specifikus aktivációjával lektinek által indukált aktiváció α-IgM, α-CD3 vagy α-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció (korai aktiváció: intracelluláris események vizsgálata) 2. Az aktivációt követő T- és B-sejt válasz jellemzése aktivációs markerek proliferatív válasz 3H-timidin beépülés CFSE fluoreszcencia feleződés sejtciklus vizsgálata Ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, CBA) 3. Az aktivált T- és B-sejtek számának meghatározása az antigén hatás után ELISPOT Intracelluláris citokin festés Pentamer (vagy tetramer) technika

4 A humorális immunválasz szakaszai
antigén felismerés aktiváció, proliferáció, differenciáció Antitest termelés Segítő T-sejt, más stimulus Klonális expanzió IgG-t expresszáló B-sejt Izotípus váltás Antigén Nyugvó IgM+, IgD+ érett B-sejt Aktivált B-sejt Affinitás érés Nagy affinitású IgG Nagy affinitású Ig-t expresszáló B-sejt Memória B-sejt

5 A T-sejt válasz szakaszai
Antigén felismerés Aktiváció Klonális expanzió Differenciáció Effektor funkciók Makrofágok, B-sejtek, más sejtek aktivációja Naív CD4+ T-sejt CD4+ Effektor T-sejt Citokinek (pl. IL-2) CD4+ Memória T-sejt Naív CD8+ T-sejt Fertőzött target sejtek ölése, makrofág aktiváció Citokinek (pl. IL-2) CD8+ Effektor T-sejt (CTL) IL-2 is the main AUTOKRINE growth factor for T-cells. High affinity IL-2 Rec also upregulated. A similar APC-produced cytokine, IL-15, stimulates proliferation of CD8+ cells, especially memorycells of the CD8+ subset. BEFORE ANTIGEN EXPOSURE: the number of spec. clones is one in lymphocytes. AFTER clonal ecpansion this ratio may be 1:10 for CD8+ and 1:100 to 1: in 1000 for CD4+ T-cells CD8+ Memória T-sejt Nyirokszervek Perifériás szövetek 5

6 B-sejt receptor komplex általi jelátvitel
Membrán Ig keresztkötése antigénnel Tirozin foszforiláció PLC aktiváció GTP/GDP csere a Ras-on, Rac-on Biokémiai intermedierek SLP-65 = BLNK Emelkedett ic Ca2+ Diacilglicerol Aktív enzimek Ca2+ dependens enzimek Transzkripciós faktorok

7 T-sejt receptor komplex általi jelátvitel
Adapter fehérjék TCR mediált jelek indítása PLC1 aktiváció GTP/GDP csere a Ras-on Biokémiai intermedierek A membránkötött adapter protein: LAT (linker of activated T cells) Erről (többek közt) egy a B sejtekben tapasztaltakhoz hasonló citoplazmás adapterre továbbítódhat a szignál: SLP-76 (v. LCP2) Emelkedett ic Ca2+ Diacilglicerol Késői jelátvitel enzimei kalcineurin MAP kinázok Transzkripciós faktorok Az áttekintett folyamatok többsége lépéseiben vizsgálható

8 Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki.
Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi. Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata.

9 A limfociták poliklonális aktivációja LPS,
lektinek, PMA+Ionomycin jelenlétében B-sejt (egér) T-sejt T-sejt TLR4 LPS is a polyclonal B-cell activator in mice. LPS works via CD14 and TLR4 receptor. Az Ionomycin a külső Ca2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA-val A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. LPS a TLR4-en keresztül aktiválja a sejteket BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák 9

10 Poliklonális B-sejt aktivátorok és hatásaik
T-sejt függés Ig szekréció Humán B-sejt PWM (pokeweed mitogen) nincs van SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) EBV (transzformáló hatású is) Anti-Ig citokinek jelenlétében Egér B-sejt LPS PWM PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) pokeweed - Phytolacca americana (Álkörmös) Poliklonális T-sejt aktivátorok Phytohaemagglutinin (PHA) lektin Canavalia ensiformis Concanavalin A (ConA) Phaseolus vulgaris anti-CD3 monoklonális ellenanyag 10

11 A limfociták aktivációjának főbb folyamatai, és azok vizsgálata
Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) - FRET foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) ic Ca2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis - IC citometria ELISA, ELISPOT Bioassay Citokin szekréció - DNS tartalom - IN antigének Sejtciklusba lépés/apoptózis A limfociták aktivációjának főbb folyamatai, és azok vizsgálata Sejtosztódás - 3H-timidin, CFSE, MTT Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul

12 A jelenlevő vagy termelt „antigének” vizsgálata
(fehérjék, citokinek, ellenanyagok, ….) vizsgálata

13 ELISA Enzyme Linked Immune Sorbent Assay ELISA plate (lemez)
lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre 13

14 felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok
enzyme linked immune sorbent enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok ellenanyaghoz konjugált enzim 14

15 Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás
Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay 15

16 Szekunder ellenanyagok
Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai (szempontok: hatékonyság, érzékenység, kényelem, megbízhatóság, ár) Direkt módszer Indirekt módszer egyszerűség több jel  nagyobb érzékenység Jelzés Szekunder ellenanyagok Jelzés Primer ellenanyag Antigén Felület

17 Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai
Enzim-antienzim rendszer (leginkább mikroszkópos immunhisztokémiában lehet találkozni vele) PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Enzimek A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyagok Szekunder ellenanyagok Primer ellenanyag Antigén

18 Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek
Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Avidin Biotin enzimComplexek (arányok!!! mint a precipitációnál) Jel felerősítése Avidin-enzim komplexek Biotin – B7 vagy H vitamin Biotin-avidin kölcsönhatás egyike a legerősebb nem kovalens kapcsolatoknak (Kd~10e-15M) Avidin – feltételezett szerepe a bakteriális növekedés inhibíciója (biotinmegvonás) A sterptavidin a kompetitorokat hivatott gátolni Biotin-enzim komplex Avidin Biotinált ellenanyag Antigén

19 Lásd a következő példákat.
Az ELISA rendszerek nem csak a vizsgált anyag jelenlétének a kimutatására, hanem ismert koncentrációjú sztenderdek segítségével a pontos mennyiség meghatározására is alkalmasak A különféle direkt-indirekt, biotin-avidin rendszereket összekombinálva is használják. Lásd a következő példákat.

20 Bioaktív anyagok kimutatása
hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek Tumor antigének kimutatása Citokinek, hormonok kimutatása doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetíciós tesztekkel

21 kombinált „szendvics” ELISA
Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. szérum, liquor, szennyvíz). citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása felesleges konjugátum kimosása A nem kötődő anyagok kimosása felesleges fehérjék kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges ellenanyagok kimosása citokintartalmú minta hozzáadása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása 21

22 Tumordiagnosztika A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor Ag specifikus csapda ellenanyaggal fedett felület (a kit része) Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hipertrófiás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával. Hasonlóan használható fel a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

23 Pajzsmirigy daganatok:
Hólyagrák: Az epiteliális sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker Pajzsmirigy daganatok: A szérum tiroglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker Alpha Fetoprotein (AFP) : 68kD-os protein, amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja hepatómával, ovariális-, tesztikuláris- és preszakrális teratokarcinómákkal, de egyéb daganatokkal is összefüggésben lehet. Carcinoembryonic Antigen (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben csak az embrionális fejlődés során van jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára. Her-2/neu protein: 185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok 20-30%-ban a tumorsejtek megemelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

24 egyszerű indirekt ELISA lépései
Antigén specifikus ellenanyag kimutatásához Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges ellenanyagok kimosása felesleges antigén kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása specifikus ellenanyagok hozzáadása Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid 24

25 Fertőzések diagnosztikája
Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia miatt), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor. emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak ilyen elven működik: Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból vagy akár beszáradt vérfoltból Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás A toxoplazmózis terhesség során veszélyes akkor, ha az anya elsődleges fertőzésben szenved. Ekkor IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és ezzel nem nyújtanak védelmet a magzat számára. látencia – sok vírus képes a szervezetben inaktív, az immunrendszer számára sem látható módon létezni az életciklusának bizonyos szakaszaiban toxoplazma fertőzöttség és megemelkedett fiú születésszám: Naturwissenschaften. 2007 Feb;94(2): Epub 2006 Sep 30. 25

26 Autoimmunitás A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják Pl. SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb anitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható). I típusú (autoimmun) diabetesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével: glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90% -ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene IA-2 (tirosine foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek 50-75% -ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető. inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)

27 izotípus specifikus ellenanyag
Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál). Az így kimutatott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti-izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető. anti-IgM anti-IgG Memória válasz IgM IgG Antigén Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma) ellenanyag capture-ellenanyag a szérum ellenanyaga izotípus specifikus ellenanyag

28 kompetitív ELISA Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás A színreakció itt fordított: több oldott antigén = halványabb szín - Kromogén anyagok hozzáadása Gyakran használják kis méretű antigének, vagy haptének esetében. Ha kevés az antigénen a hozzáférhető epitop, a szendvics ELIZÁban lefoglalja ezeket az első „capture” ellenanyag. 28

29 ELISA alaptípusok (összefoglalás)
capture/szendvics egyszerű Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag detektor/reporter ellenanyag Ag specifikus ellenanyag antigén Ag specifikus capture ellenanyag antigén pl. antigén specifikus ellenanyagok kimutatásához antigének kimutatásához az oldatban jelen van a kimutatandó Ag kompetitív nincs jelen oldott Ag Ag specifikus ellenanyag antigén kis mennyiségű, kis méretű antigén kimutatásához (elég ha ha csak egyféle specifikus ellenanyaggal rendelkezünk)

30 ELISA hibák Aspecifikus kitapadásból eredő hiba - akár közvetlenül
Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: telítéssel/blokkolással detergens alkalmazásával hook effect! – nagy koncentráció vagy kevés mosás miatt 30

31 Megfelelően beállított szendvics ELISA
ELISA hibák Nagyon magas antigén koncentráció esetén, a jelenlévő szolubilis antigén kompetitálhat a felszínhez kikötöttel. Hook effect - fals negatív vagy fals alacsony eredmény Gyakori lehet nem megfelelően beállított egylépéses imminoasayeknél, vagy nem hatékony/nem elégséges mosási lépések esetén A túl magas antigén koncentráció, vagy nem megfelelő mosási lépések miatt, a jelenlevő szolubilis antigénhez kötődnek a jelzett ellenanyagok, ami fals negatív vagy a valósnál alacsonyabb eredményt ad Megfelelően beállított szendvics ELISA

32 Elkészült ELISA lemezek

33 pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből
Diagnosztikai gyorstesztek: pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak!

34 hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal
elölnézet oldalnézet abszorbciós rész (cellulóz, papír) kontroll ellenanyag sáv nitrocellulóz membrán hCG csapda ellenanyag sáv jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter (A jelzés szabad szemmel is látható!) abszorbciós lap, mintafelviteli rész Az „ellenanyaggal átitatottság” valószínűleg liofilizátumot jelent vizeletminta

35 a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok
kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG kontroll ellenanyag sáv hCG csapda ellenanyag sáv A tesztcsíkook egy adott antigén koncentráció tartományra vannak belőve!!! Ennél a formánál a nagyon magas hCG koncentráció fals negativitást mutatna! : (hook effect – a sok szabad hCG ráköt a csapda sávra és az ellenanyaggal jelölt hCG már nem tud kikötni rá) jelölt ellenanyagok Elvben a szendvics ELISÁra hasonlít hCG

36 Ugyanez kompetitív rendszerben
kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok hCG sáv ( kikötött hCG) A kompetitív ELISA elve hasonló

37 kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek)
Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre: kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) festékkel töltött latex gyöngyök Az eljárás szemikvantitatívá tehető Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei: élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása kolloidális méretű nemesfém partiulumoknak speciális fényelnyelési, gerjesztési, fényszórási sajátságai lehetnek, aminek eredményeképp intenzív színjelenséget tapasztalni. (élénk színűnek látszanak) A jelenség a localized surface plasmon resonance (LSPR) –hoz tartozik. Aflatoxins are naturally occurring mycotoxins that are produced by many species of Aspergillus, a fungus, the most notable ones being Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Aflatoxins are toxic and among the most carcinogenic substances known.  After entering the body, aflatoxins may be metabolized by the liver to a reactive epoxide intermediate or hydroxylated to become the less harmful aflatoxin M1 „Fáraó átkának” egy racionálisabb magyarázata Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására 37

38 Enzyme Linked Immuno-Spot
ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot Elve hasonlít az ELISA-hoz Eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtek számának meghatározására szolgált. Ma alkalmas egyéb szolubilis effektor molekulák, pl. citokinek, kemokinek, granzim termelő sejtek számának meghatározására is. Egyaránt alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására. Érzékenység: kb. 1 per sejt Az első lépéseit sejtkultúrában aszeptikus körülmények között végzik.

39 ELISPOT A mérés menete - a capture ellenanyagok kitapasztása
- blokkolás - a sejtek hozzáadása (aktiválás, inkubáció) - mosás - biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása (például) - avidin-enzim konjugátum Az ELISPOT lemez egy lukának felülnézete a képződött foltokkal - oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (AEC 3-amino-9-etilkarbazol) A citokin termlő sejt helyét mutató folt

40 Leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka)
vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors + standardizálható spot szám és méret meghatározás)

41 A spotok száma az ellenanyag vagy citokin termelő sejtek számát mutatja
Egy spot mérete arányos a sejt által termelt ellenanyag vagy citokin mennyiségével A spotok által elfoglalt összterület mindkét paramétert egyesíti, a számítógépes szoftver mindkettőt figyelembe veszi

42 Azok tulajdonságai (pl. foszforilációs állapota) is vizsgálható vele.
Western blot Fehérjekeverékek egyes (pl. sejt lizátumok) komponenseinek ellenanyag segítségével történő specifikus kimutatására alkalmas. Azok tulajdonságai (pl. foszforilációs állapota) is vizsgálható vele. Az aktiválás utáni különböző időpontokban „befagyasztható” a sejtek állapota (lízis puffer, és enzim-inhibítorok hozzáadása), így vizsgálhatóak pl. a sejtaktiváció foszforilációs eseményei sok, legalább 106 sejt szükséges a vizsgálathoz

43 A fehérjék SDS-PAGE-enelektroforetikus mobilitásuk alapján „méret” szerint szétválaszthatók (dot-blot vagy slot-blot esetén nincs szétválasztás) A hozzávatőleges méretet ismert méretű standard fehérje keverék egyidejű futtatásával meghatározhatjuk. A kezelhetőség érdekében a szétválasztott fehérje sávokat membránra viszik át (PVDF, nirocellulóz) Polyvinylidene fluoride (PVDF) – nem specifikus affinitása van fehérjékre (aminosavakra) (hidrofób kölcsönhatások) Specifikus ellenanyaggal mutatható ki a keresett fehérje sávja a többi sáv között, (vagy anti-foszfotirozin elleanyaggal a foszforilált fehérjék sávja)

44 Western Blot Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik: enzimmel konjugált ellenanyag indirekt módszer (primer és szekunder ellenanyagok) Protein minta Standard Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján Western blot SDS-PAGE Membrán

45 pl. aktivált T sejtek foszfotirozin és Zap-70 blotja
A membrán az anti P-Y ellenanyagok elúciója után anti ZAP-70 ellenanyagokkal is megjelölhető, így azonosítható a ZAP-70 foszforilációs állapota a sejtekben aktiválatlan ConA PHA Y P-Y P-Y P-Y blot

46 A pozitív HIV tesztet megerősítő WB vizsgálati módszerek:
Western-blot: HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak. p24 – kapszid fehérje burokfehérjék – gp120, gp41 (gp160) 46

47 Megnövelt kemilumineszcencia /Enhanced chemiluminescence (ECL)/
H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol) Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer) Immobilizált proteinek Primer ellenanyag Fab Fc Torma- peroxidáz luminol H2O2 h Epitóp a protein felszínén luminol enhancer Detektálás H2O Szekunder ellenanyag Membrán

48 „Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (high throughput) citokin vizsgálatok
(1. ) (proteomika)

49 Vizsgálandó citokin tartalmú oldat
Cytokine array Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas A Western-blot blotolási lépését követő részére hasonlít különféle kikötött specifikus ellenanyagok Jelzett ellenanyagok keveréke Vizsgálandó citokin tartalmú oldat ( + ) IL-2 IL-4 … MIP3β … IFN Az ellenanyag általában enzimmel (peroxidáz) konjugált. A láthatóvá tétel alapul kemolumineszcencián, a WB-hoz hasonlóan Szendvics ELISÁval analóg módszer – a membrán egy-egy foltja az eliza lemez egy-egy lukának felel meg Mennyiségi meghatározás – inkább az egyes citokinek relatív mennyiségét lehet meghatározni vele … ( - ) Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

50 CD40L+SLAM kombinációval aktivált moDC citokin termelése
Réthi és mtsi. 2006

51 Immunhisztokémia / Immunfluoreszcencia
Szöveti vagy sejthez kötött komponenseket mutathatunk ki specifikus AG- EA reakció alapján. (a fixált szövetmetszet szilárd fázisnak felel meg.) Fixálás: A minta átjárható legyen és az Ag determinánsok ne károsodjanak paraformaldehid, glutáraldehid – kémiai keresztkötések alkoholok – vízelvonó szer (szövettípustól és az antigéntől függően) Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban Immunfluoreszcencia fluoreszcensen jelzett ellenanyag – fluoreszcens mikroszkóp FITC – fluoreszcein izotiocianát PE – fikoeritrin, stb. Immunoenzim módszer enzimmel konjugált ellenanyag P – peroxidáz PA – alkalikus foszfatáz (a szubsztátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek) Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

52 IMMUNHISZTOKÉMIA „FESTÉS” - rácseppentett reagensekkel
FIXÁLÁS METSZÉS Szövetminta Festés előtti metszet FAGYASZTÁS „FESTÉS” - rácseppentett reagensekkel

53 Immunhisztokémia ABC Technika (lásd a korábbi diát is)
Enzim X Avidin Biotin Secunder antitest Primer antitest Tárgylemez Sejtek (sejttenyészetek) Szövetmetszet

54 normál hisztokémia (nem immun)
Acute bronchopneumonia (hematoxilin- eozin festés)

55 (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)
Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

56 Fluoreszcens immunhisztokémia (TRITC) Aktin mikrofilamentek kimutatása

57 Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt
Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugált phalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg.

58 A pozitív HIV tesztet megerősítő vizsgálati módszerek:
Western-blot (lásd a korábbi dián) HIV-1 fertőzött CEM sejtvonal (T-sejt vonal) antigénjeinek Western-blotja. Az antigéneket tartalmazó blot-membránt a vizsgálandó szérummal inkubálják. A fertőzött személy szérumában található anti-HIV ellenanyag specifikus sávot (sávokat) eredményez a bloton. Legalább két burokfehérjét, vagy egy burokfehérjét és a p24 antigént kimutató sáv jelenléte esetén tekintik pozitívnak. Immunfluoreszcens vizsgálat: A teszt immortalizált, HIV-1 antigéneket expresszáló T sejt vonalat használ. A sejteket tárgylemezre fixálják, és a vizsgálandó szérummal inkubálják, majd humán Ig specifikus fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyagokkal jelölik. Negatív kontrollként nem fertőzött sejtvonalat használnak. A festődés mértékét és mintázatát összevetve a kontrollal erősítik meg a fertőzöttséget. p24 – kapszid fehérje burokfehérjék – gp120, gp41 (gp160) 58

59 Autoimmunitás immunfluoreszcens diagnosztikája
A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is ki lehet mutatni Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában, immunofluoreszcencia segítségével (indirekt festés)

60 A termelődött citokinek intracelluláris kimutatása
immunfluorimetriával jelzéssel ellátott citokin-specifikus ellenanyag - a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá kell tenni - de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció) előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők („sejttípus marker” pl. CD4) citokinek 60

61 Eredmény: Megtudható az is belőle, hogy milyen sejttípusok termelték a citokineket! Érzékenysége elérheti a Western blot-ét (hűtött CCD kamerás mikroszkóppal– akár egyetlen sejt is elegendő lehet a vizsgálathoz)

62 Bioassay Citokinekre érzékeny (citokin szenzitív), vagy csak citokinek jelenlétében túlélni/osztódni képes (citokin dependens) sejtvonalak segítségével a jelenlevő citokinek nagy érzékenységgel kimutathatók. pl. CTLL2 sejtek van IL-2 nincs IL-2 pl. Wehi 164 sejtek van TNF nincs TNF

63 A sejtek túlélését kolorimetriás eljárással (pl
A sejtek túlélését kolorimetriás eljárással (pl. MTT assay) vagy az osztódásuk kimutatásával (lásd később) mérhetjük meg. MTT assay: citokinkoncentráció IL-2 TNF CTLL2 Wehi 164 MTT – tiazolil kék – aktív mitokondriumok alakítják át a sárga festéket vízoldhatatlan bíbor/kék kristályokká – alkoholban, detergensben oldható és fotometrálható Bizonytalanná teheti a kapott eredményt, hogy a sejtek nem biztos, hogy csak az adott citokinre reagálnak. Pl. a CTLL2 sejtvonalra az IL4 hasonló hatást fejt ki, mint az IL2.

64

65 (áramlási citométerrel)
„Nagy szélességű” v. „nagy áteresztőképességű” (brute-force v. high throughput) citokin vizsgálatok (2.) (áramlási citométerrel) (proteomika) Az eljárás kis térfogatokkal (5-20ml) is működik, de műszerigényes.

66 A cyitokine array-hez hasonló alapelvű áramlási citometriás módszer.
Cytometric/multiplex bead array (CBA) A cyitokine array-hez hasonló alapelvű áramlási citometriás módszer. A citokineket itt nem a pozíciójuk, hanem különböző színintenzitású gyöngyök azonosítják IL-2 IL-4 IL-8 … IL-12 IL-23 IL-17 CBA cytokine array Szendvics ELISÁval analóg elv A citokin array-en és ELISÁBan a membránon levő folt, vagy az ELISA lemez lukának a pozíciója alapján tudjuk, hogy milyen citokint detektálunk, amíg a CBA esetében a capture gyöngyök színe alapján tudjuk, hogy milyen citokint detektálunk a gyöngy felszínén

67 Cytometric/multiplex bead array (CBA)
A CBA elve és összehasonlítása a hagyományos ELISAval Szendvics ELISA CBA IL-2 „reporter” ellenanyag IL-2 A szendvics ELIZÁban tudjuk, hogy az ELIZA lemez melyik lukában milyen citokint fogunk detektálni, hiszen tudjuk milyen capture ellenanyaggal coatoltunk. A CBA-ban a (capture)gyöngyök színe (pontosabban a színintenzitása) alapján tudjuk megmondani, hogy milyen citokint detektálunk vele. A másik ellenanyag színintenzitása a citokin mennyiséggel lesz arányos. IFNg IL-4 IL-2 capture ellenanyagok

68 Citokin standard hígítási sorozat
Citokin mennyiség A citokinek mennyiségére az eltérő színnel jelölt „reporter” ellenanyag fényintenzitásából következtethetünk TNFα IL-6 IL-8 Egy minta értékeinek összevetése a standardal IL-12 IL-10 IL-1β 500pg/ml 250pg/ml 125pg/ml 62pg/ml 31pg/ml 16pg/ml 8pg/ml Citokin standard hígítási sorozat

69 Az intracelluláris (citoplazmatikus) Ca2+ szint meghatározása
A citoplazmatikus Ca2+ koncentráció növekedése pl. fluoreszcens indikátor festékekkel vizsgálható. /Fluo-3 vagy az Indo-1/ példa – intracelluláris Ca2+ jel egy sejtben kimutatva: antigén prezentáló B sejt T sejtet aktivál (klikk a képre) B sejt T sejt (klikk a képre)

70 A génaktiváció vizsgálata
A sejtaktiváció az aktiválódó génekről átíródó mRNS segítségével is kimutatható pl. citokin gének aktivációja módszer: RT-PCR, QRT-PCR sejtek  RNS izolálás RNS  (reverz transzkriptáz)  cDNS TaqMan probe: A primer pár által meghatározott szakasz közé hibridizálni képes rövid oligo. Egyik végén egy fluorokróm, a másik végén egy quencher. Amíg egymás közelében vannak, a quencher nem engedi a fluorokrómot fényt leadni (mechanizmus – FRET). A Taq polimeráz a ciklus során előrehaladva a DNS-en az exo?nukleáz aktivitásával lehasítja a TaqMan próba bázisait így felszabadítja a fluorokrómot a quencher hatása alól. A ciklusok során egyre több próba hasad el, a fluoreszcencia emelkedik. cDNS  (PCR)  hossz és mennyiség meghatározás RT-PCR: agaróz gél (pl. denzitometria) QRT-PCR: fluoreszcens módszer (TaqMan probe (FRET) v. interkaláló fluorokróm  SYBR green) 70

71 blasztos transzformáció
Sejtciklus a sejtciklusba lépő sejtek mérete megnövekszik = blasztos transzformáció transzkripció kimutatása (RT-PCR) fehérjék kimutatása (Immunoassay) sejtszám változás meghatározása (CFSE) DNS mennyiség meghatározása (fluoreszcens DNS interkalátorok, 3H-timidin)

72 A sejtciklus vizsgálható a DNS mennyiség alapján, pl.
a DNS-be sztöhiometrikus módon interkalálódó fluoreszcens festékekkel (propidium jodid, PI) G0 M G2 DNS analízis (pl.aneuploidia diagnosztikájához) G1 G0 G1 s sejtszám s G2 M Ha egymáshoz tapad 2db G0/G1 sejt (pl. Az osztódás után, vagy a SLAM miatt  ), akkor a méréskor úgy látszanak mintha G2 –ben lenne egy sejt. Ez az artefaktum az ún. doublet-discrimination módszerrel kizárható. A sejt áthaladási idejét méri a lézeren: a dupla sejtnek kétszer annyi idő kell. Ez alapján kikapuzható. 2N 4N 200 400 600 800 1000 DNS mennyiség Egy sejtpopuláció sejtjeinek eloszlása DNS mennyiség alapján (áramlási citometriás ábra) 72

73 A B-/T-sejt proliferáció mérésére
alkalmas módszerek 3H-jelölt timidin-beépülés a totál DNS-beépülést méri. Nem méri, hogy hány sejt hányszor osztódott (β-bomlás mérése). A timidin-analóg bromodeoxyuridin (BrdU) alkalmazható kísérleti állatokban és sejtkultúrákban is. Az osztódó sejtek BrdU-specifikus ellenanyag felhasználásával kimutathatók (mikroszkópia, FACS). Also perfect as a tracer of any injected cells in vivo Újabban a karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter, CFSE használata terjedt el. 73

74 A sejtosztódás meghatározása
A „Cell tracer” festékek bediffundálnak a sejtbe, és sokáig megőrződnek. Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az intracelluláris fehérjékhez. Amikor az intracelluláris festék a két utódsejtbe szétosztódik, a fluoreszcencia intenzitás felére csökken. sejtosztódások: A karboxifluoreszcein diacetát szukcinimidil észter (CFSE) a kapcsolt acetát-észter csoporttól apoláros, így képes átjutni a lipidmembránon. A sejtben levő észterázok az acetát csoportot lehasítva csapdába ejtik, és a reaktív szukcinimidil csoport kovalensen kötődik az fellelhető amin csoportokhoz (pl. lizin oldalláncok). 74

75 T-sejtek funkcionális vizsgálata
Antigén specifikus T-sejtek azonosítása Hasznos lehet pl. immunizálás eredményességének vizsgálatakor T-sejt klónok ugyanolyan T-sejt receptorral antigén specifikus T-sejt immunizálás Ha a T-sejt receptorok specificitása meghatározható, akkor a felszaporodott antigén specifikus T-sejtek kimutathatóak.

76 T-sejt Megjelölt MHC-peptid komplex felhasználható
a rá specifikus T-sejt receptor kimutatására De az MHC kötődése a T-sejt receptorhoz kis affinitású MHC T-sejt receptorok egy MHC molekula és T-sejt receptor kölcsönhatása nem elég erős T-sejt

77 Pentamer (vagy tetramer) technika
Multimerizált MHC-peptid komplex aviditása már kellően erős lehet. Pentamer (vagy tetramer) technika a létrejövő pentamer self assembling coiled-coil-domain MHC peptid fluoreszcens jelzés a pentamer egyik alegysége

78 T-sejt Az MHC pentamer kötődése a T-sejthez
Az MHC-peptid oligomer reakciója a specifikus T-sejt receptorokkal nagy aviditású. MHC pentamer MHC multimerek segítségével meghatározható az antigén-specifikus T-sejtek száma, értékelhető pl. a vakcinák, vagy egy adott terápiás eljárás hatékonysága. T-sejt receptorok peptid-specifikus T-sejt Ide kattints az animációhoz

79 MHC Dextramerek

80 CMV-specifikus T-sejtek normál HLA-A2 donorban
EBV BZLF-1 (RAKFKQLL/ HLA-B*0801)-specifikus T-sejtek (a normál populáció 90-95%-a hordozó) MHC multimer jelöléses példák A perzisztáló (pl. herpeszvírusok) vagy visszatérő fertőzések miatt a specifikus T-sejtek száma viszonylag magas lehet CMV-specifikus T-sejtek normál HLA-A2 donorban Influenza epitóp (GILGFVFTL/ HLA-A0201)-specifikus T-sejtek egészséges donorban CMV – cytomegalovírus (Herpesvírus, mint az EBV) nyálmirigyben, vesében egészséges személyben is egész életen át perzisztálhat 80

81 Antigén specifikus T sejtek kimutatására alkalmas MHC-peptid pentamer példák
allél szekvencia Tumor (asszociált) epitop peptid eredete A*0201 GVLVGVALI Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) LLGRNSFEV p LLLLTVLTV MUC RLLQETELV HER-2/neu RMFPNAPYL Wilm's Tumour (WT1) SLLMWITQV NY-ESO STAPPVHNV MUC VISNDVCAQV Prostate Specific Antigen-1 (PSA-1) VLQELNVTV Leukocyte Proteinase-3 (Wegener's autoantigen) VLYRYGSFSV gp100 (pmel17) YLEPGPVTA gp100 (pmel17) YLSGANLNL Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) KVLEYVIKV MAGEA KVAELVHFL MAGEA KTWGQYWQV gp100 (pmel17) HLSTAFARV G250 (renal cell carcinoma) ILAKFLHWL Telomerase ILHNGAYSL HER-2/neu IMDQVPFSV gp100 (pmel17) KIFGSLAFL HER-2/neu LMLGEFLKL Survivin ALQPGTALL Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) 14-22 CMTWNQMNL Wilm's Tumour (WT1) ELAGIGILTV MelanA / MART 26-35 FLTPKKLQCV Prostate Specific Antigen-1 (PSA-1) GLYDGMEHL MAGEA A*0301 KQSSKALQR bcr-abl 210 kD fusion protein 21-29 ATGFKQSSK bcr-abl 210 kD fusion protein ALLAVGATK gp100 (pmel17) 17-25 A*2402 VYGFVRACL Telomerase reverse transcriptase (hTRT) TYLPTNASL HER-2/neu 63-71 TYACFVSNL Carcinogenic Embryonic Antigen (CEA) TFPDLESEF MAGEA EYLQLVFGI MAGEA AFLPWHRLF Tyrosinase B*0801 GFKQSSKAL bcr-abl 210 kD fusion protein 19-27 A vizsgált személy szövettípusának megfelelő MHC multimer szükséges hozzá allél szekvencia EBV epitop A*0201 CLGGLLTMV EBV LMP GLCTLVAML EBV BMLF A*1101 IVTDFSVIK EBV EBNA A*2402 TYGPVFMCL EBV LMP B*0702 RPPIFIRRL EBV EBNA-3A B*0801 FLRGRAYGL EBV EBNA-3A RAKFKQLL EBV BZLF B*3501 HPVGEADYFEY EBV EBNA allél szekvencia Influenza A epitop A*0101 CTELKLSDY Influenza A (PR8) NP 44-52 A*0201 GILGFVFTL Influenza A MP 58-66 A*0301 ILRGSVAHK Influenza A (PR8) NP allél szekvencia HIV epitop A*0201 ILKEPVHGV HIV-1 RT KLTPLCVTL HIV-1 env gp SLYNTVATL HIV-1 gag p TLNAWVKVV HIV-1 gag p A*0301 QVPLRPMTYK HIV-1 nef 73-82 RLRPGGKKK HIV-1 gag p A*2402 RYLKDQQLL HIV-1 gag gp B*0702 IPRRIRQGL HIV-1 env gp TPGPGVRYPL HIV-1 nef B*0801 FLKEKGGL HIV-1 nef 90-97 GEIYKRWII HIV-1 gag p B*2705 KRWIILGLNK HIV-1 gag p H-2Kd AMQMLKETI HIV-1 gag p

82 MHC TIPIZÁLÁS A TRANSZPLANTÁCIÓS IMMUNOLÓGIA GYAKORLATI VONATKOZÁSAI
ember – HLA tipizálás laboratóriumi egér – H2 tipizálás (miért nincs szükség rá?)

83 HLA tipizálás szövet/szerv transzplantációkhoz
MHC I: HLA-A, HLA-B, HLA-C MHC II: HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR szövet/szerv transzplantációkhoz általában a HLA-B és a HLA-DR a legfontosabb a HLA-C kevéssé immunogén, gyakran alig befolyásolja a transzplantáció eredményét diagnosztikai értéke van HLA és a különféle betegségek között összefüggés lehet (HIV-rezisztenciás esetek egy része is adott spec HLA-B allélhez köthető) Fogalmak: autológ - saját eredetű (MHC azonos) allogén - idegen eredetű (MHC különbségek) xenogén - idegen faból származó (MHC és akár „vércsoport” antigén különbségek is)

84 Transzplantációs reakciók
(allorektivitás) HLA-A, B, C, DR, DQ, DP, és minor hisztokompatibilitási antigének jelentősége idegen MHC-antigének T sejtek általi felismerése Direkt: saját T sejtek - donor APC-k (CD8+ T sejt válasz) Indirekt: saját APC bemutatja a donor MHC-molekula katabolizmusából származó fragmenteket (CD4+ T sejtek) citokin felszabadulás Hiperakut rejekció Okok: alloantigénekkel szembeni előzetes immunizácó, preformált anti-HLA ellenanyagok, ABO-vércsoport inkompatibilitás, xenotranszplantáció antitestek kötődnek a szerv endotél sejtjeihez komplementrendszer aktiválódása trombózis vascularis necrosis terápia rezisztens APC – antigén prezentáló sejt (MHC I esetében szinte bármely testi sejt lehet!) GYULLADÁS

85 HLA allotípusok és betegségek közötti kapcsolatok
(autoimmun) HLA gyakoriság beteg kontroll SLE DR3 55 20 B8 50 Hidralazin(?) indukált lupus erythematosus DR4 73 32 Basedow-kór 56 25 43 Krónikus aktív hepatitis 21 Sclerosis multiplex DR2 60 30 B7 37 24 Myasthenia gravis 44 Autoimmun IgA glomerulonephritis 53 19 I. típ. diabetes 72 49 22 40 Addison-kór (idiotópiás, autoimmun) 70 46 23 Sjörgen-szindróma Coeliaka 79 DR7 15 68 Goodpasture-szindróma 88 29 IgA hiány 81 Dermatitis herpetiformis 82 75 De Qervain-thyreoiditis B35 Reiter-szindróma B27 9 Felty-szindróma 95 Betegségek HLA gyakoriság beteg kontroll Narcolepsia DR2 100 22 Bechterew-kór B27 89 9 Adrenogenitális szindróma Sóvesztő forma Késői forma Virilizáló forma Bw47 36 1 B14 57 4 B5 48 10 Psoriasis vulgaris Cw6 56 15 B13 24 8 B17 27 DR7 23 Idiopátiás haemochromatosis A3 76 28 Bechet-kór B51 50 11 Arany indukált thrombocytopenia DR3 13 Arany indukált leukopénia 47 HLA allotípusok és betegségek közötti kapcsolatok A kontroll csoport a vizsgált betegcsoporttal azonos helyről származik. Az adatok eltérő régiókból lettek összegyűjtve. Ez az oka a kisebb százalékos eltéréseknek ugyanazon HLA típusok kontroljai között különböző betegségek kapcsán megemlítve. forrás: Klinikai immunológia (II. klinikum) (OHVI 1990 szerk.: Szegedi, Gergely, Sipka, Szemere) Stenszky Valéria: Autoimmun betegségek genetikai vonatkozásai

86 Ha a tipizáló szérum nem reagál a sejtekkel, nincs lízis
HLA tipizálási módszerek: A régi klasszikus módszer: Szerotipizálás A tipizálandó vérsejtek és a tipizáló szérum közötti szerológiai reakción alapul. Az MHC I és/vagy MHC II molekula változatokat felismerő ellenanyagokat tartalmazó szérumok segítségével véghez vitt komplement mediált lízis/sejtkárosítás. Ha a tipizáló szérum nem reagál a sejtekkel, nincs lízis (az elpusztult/károsodott sejteket festék hozzáadásával teszik láthatóvá) A tipizáló szérumokat régen immunizálódott személyektől gyűjtötték (pl. többször szült nők, vérátömlesztést kapott személyek - többféle MHC allél ellen immunizálódtak), ezt később monoklonális ellenanyagokkal váltották ki. A szérumok/ellenanyagok specifitásának jellemzése és az új HLA allélek azonosítása nemzetközi workshopok keretében történik. A rendelkezésre álló, jól karakterizált szérumok mennyisége mindig limitált – ezért mikrotiter tálcákon végzik a vizsgálatokat (mikrocitotoxicitási vizsgálat, Terasaki plate)

87 Szerotipizálás Az MHC II (HLA-DP, DQ, DR) allotípusokat B sejteken vizsgálják perifériás vér, Ficoll gradiens  PBMC PBMC, olcsó nylonvatta szlop  dúsított B sejtek Az MHC antigének kompatibilitását kevert limfocita reakcióval (MLR) is vizsgálhatják. - Kétirányú MLR – mindkét donor T limfocitái válaszolnak - Egyirányú MLR – az egyik személy limfocitáinak osztódását gátolják (γ besugárzás, sejtosztódás gátló Mitomycin C kezelés) AZ ALLOREAKTÍV AKTIVÁLÓDÓ LIMFOCITÁK ARÁNYA EGY ADOTT EGYEDBEN NAGYON MAGAS LEHET (1-10%) (alloreaktivitás és MHC restrikció látszólagos paradoxonának szemléletes feloldása: az allogén MHC a saját T sejt számára úgy „látszik”, mintha saját MHC lenne idegen peptiddel)

88 Genetikai vizsgálatok
A szerotipizálásnak vannak korlátai: – gyakori keresztreakciók (HLA-B27 – HLA-B7, nem csak a poliklonális szérumok miatt) – HLA-C ellen (alacsony immunogenitású), kevés specifikus szérum – egyes variációkat, kis eltéréseket nem képes detektálni Szerológiai módszerekkel a változatok töredékét lehet csak kimutatni! Genetikai vizsgálatok PCR-SSP (Sequence Specific Primer) ha ismert a szekvencia Különféle egyedi HLA szekvenciákra specifikus primerekkel elvégzett sokmintás PCR vizsgálat. Az allél specifikus primerpárok segítségével, a PCR reakcióban megsokszorozott génszakaszok kimutathatók az agaróz gélben HLA-A …

89 Genetikai vizsgálatok
PCR-SSOP (Szekvencia Specifikus Oligonokleotid Próba) Jelzéssel ellátott, allél specifikus oligonukleotidok hibridizációja a vizsgált személy DNS-éhez. A vizsgálandó személy HLA génszakaszait PCR–rel sokszorosítják (nem allél specifikus primerekkel). A terméket nitrocellulóz membránon vagy mikrotiter tálcákon immobilizálják és különféle allél specifikus jelölt oligonukleotidokkal hibridizálják. A jelölés lehet radioaktív, enzim vagy fluoreszcens. – példát lásd a következő diákon (ELPHA ) SBT (Sequence Based Typing) DNS szekvenálással állapítják meg az allotípust (egészen kis eltérések, és új változatok is kimutathatóak vele)

90 ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay)
Egy gyakorlati példa PCR-SSOP-re: ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay) (1. lépés) - Vérből szeparált PBMC-ből genom DNS izolálás - Az MHC II gének 2. exonjának és az MHC I gének 2. és 3. exonjának amplifikálása PCR-reakcióval. A primerek nem allél specifikusak, de biotinnal jelöltek. DP DQ DR B C A

91 ELPHA (Enzyme Linked Probe Hybridization Assay)
(2. lépés) A PCR amplifikátumot mikroteszt („ELISA”) lemez lukjaiba osztják szét. A lukak alja sztreptavidinnel fedett, és az egyes lukak liofilizált formában tartalmazzák a különféle allélszakaszokkal komplementer szekvencia specifikus oligonukleotidokat (SSOP). A biotinált amplifikátum kikötődik a sztreptavidinre, és egyidejűleg visszaoldja az oligonukleotidokat. A komplementer szekvenciák hibridizálnak, és a mosás után csak az adott allélekre specifikus oligonukleotidok maradnak a lemezen. biotinált PCR amplifikátum Sztreptavidin Az oligonukleotidokon levő jelzést pl. enzim konjugált ellenanyag ismeri fel. Az enzim megfelelő szubsztráttal színreakciót katalizál. (Jelen esetben az oligonukleotidon levő jelzés nem lehet biotin, mert az „foglalt”. Lehet pl. digoxigenin, vagy FITC. A FITC ebben az esetben nem fluoreszcens jel, hanem ún. „tag”)

92 pl. HLA-A tipizáló lemez (3.lépés)

93 szekvencia alapon 2006 októberéig leírt HLA-A allélek (480db)
(egy régebbi nomenklatúra szerint) ( és a szerológiai alapon jellemzett HLA-A allélek (28db): 2579-ben lehetnek same sense allélek, nem kódoló régióban eltérők, null allélek A leírt allélek száma évről évre nő: 2014: 2579 HLA-A allél 1833 HLA-A fehérje 87 null allél

94 2014-es HLA nomenklatúra http://hla.alleles.org/
A szekvenálás térhódításával rengeteg új allélt/változatot mutatnak ki, ezért a nomenklatura rendszeres frissítésre szorul 2014 januárjáig különböző HLA allélt (A,B,C, DP, DQ, DR,…) írtak le

95 TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK
Ártalmatlan anyagok bejutása egyes emberekben túlérzékenységi reakciókat válthat ki Nemkívánatos gyulladáshoz, sejtek és szövetek károsodásához vezet Az immunrendszer az idegen anyagra nem megfelelően reagál Többnyire ártalmatlan anyagok hatására alakul ki, másodszori (esetleg többszöri) találkozás eredményeként

96 TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK ÁTTEKINTÉSE
I. típusú „azonnali” II. típusú III. típusú IV. típusú „késői” Ellenanyag mediált T sejt mediált - az elején szenzitizációval indulnak - gyakran autoimmun megbetegedésekkel kapcsolatban - a típusok effektor mechanizmusai átfedhetnek – tünetek egy része hasonló lehet - sok olyan eset lehetséges amikor nem tisztán az egyik vagy a másik típus jelenik meg (pl. I – IV)

97 AZ ELLENANYAG MEDIÁLT TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓK TÍPUSAI
II. típus III. típus I. típus Ellenanyag izotípus Sejtfelszíni vagy mátrix-kötött antigén Szolubilis antigén Sejtfelszíni receptor Szolubilis antigén Antigén Komplement, FcR+ sejtek (fagociták, NK-sejtek) Az ellenanyag megváltoztatja a jelátvitelt Effektor mechanizmus Hízósejt aktiváció Komplement, fagociták Urtikária (urticaria) = csalánkiütés FcRIα=a receptor alpha alegysége Egyes gyógyszer-allergiák (pl. penicillin) Példa Allergiás rhinitis, asthma bronchiale, anaphylaxia Krónikus urtikária (ellenanyag az FcRIα ellen) Szérumbetegség, Arthus-reakció

98 I. TÍPUSÚ TÚLÉRZÉKENYSÉGI REAKCIÓ
„azonnali” hiperszenzitivitási reakció „klasszikus” ALLERGIA

99 A szenzitizáció folyamata
Antigén-specifikus T-sejtek aktivációja IgE termelés és azok kötődése a hízósejtek felszínéhez Első találkozás a pollennel Az antigén bejutása, felvétele (Az antigénprezentáció a naív T sejtek számára és a naív B sejtek aktivációja természetesen a nyirokcsomóban történik)

100 AZ ALLERGÉN HATÁSÁRA A HÍZÓSEJTBEN KIVÁLTOTT REAKCIÓK KÉSŐI MEDIÁTOROK
KORAI MEDIÁTOROK (raktározott) Biogén aminok – hisztamin Enzimek – triptáz, kináz, karboxipeptidáz KÉSŐI MEDIÁTOROK

101 korai (tárolt) mediátorok
Termék típusa Termék Biológiai hatások enzim kötőszöveti ‘remodelling’ toxikus mediátor toxikus a parazitákra növeli az erek permeabilitását simaizom összehúzódáshoz vezet gyulladáskeltő, különböző sejttípusok citokintermelését serkenti, aktiválja az endotéliumot TNFα (egy része granulumokban raktározva) citokin serkentik és erősítik a Th2-választ granulocita termelés és aktiválás kemokin monocita, makrofág és granulocita toborzás simaizom összehúzódáshoz vezet növeli az erek permeabilitását serkenti a nyáktermelést lipid-mediátor leukociták toborzása, lipidmediátorok felszabadulásának serkentése, neutrofilok, eozinofilok és trombociták aktiválása A TNFa tároltan is megtalálható, és késői mediátor is

102 A hízósejt degranuláció hatása függ a szöveti környezettől
Hízósejt aktiváció és degranuláció Emésztőrendszer Légutak Vérerek Megnövekedett emésztőnedv szekréció és perisztaltika Csökkent átmérő és megnövekedett nyáktermelés Megnövekedett vérátáramlás és permeabilitás Köhögés, mellkasi szorítóérzés, sípoló légzés Hányás, hasmenés, hasi görcsök Ödéma, gyulladás és megnövekedett antigénszállítás a nyirokcsomókba 102

103 AZ IgE ÁLTAL KÖZVETÍTETT HIPERSZENZITIVITÁS TÍPUSAI
SZINDRÓMA GYAKORI ALLERGÉNEK A BELÉPÉS HELYE VÁLASZ szisztémás anafilaxis gyógyszerek állati mérgek földi mogyoró intravénás (közvetlen vagy szájon át történő felszívódás ödéma ér áteresztő képesség növekedése tracheális okkluzió keringés összomlása halál akut urtikária rovar csípés allergia teszt szubkután a véráram lokális fokozódása éráteresztő képesség növekedése Allergiás rinitisz szénanátha pollen házi atka ürülék belégzés orr nyálkahártya ödéma orr nyálkahártya irritáció asztma állatszőr légutak szűkülete fokozott nyálka képződés légutak gyulladása étel allergia csonthéjasok földimogyoró halak, kagyló tej, tojás szájon át hányás hasmenés pruritusz (viszketés) urtikária (csalánkiütés) anafilaxis (ritka)

104 Passzív kután anafilaxis
Hízósejtek működésének vagy antigén specifikus IgE jelenlétének vizsgálata kísérleti állatmodellben: Passzív kután anafilaxis A bőrbe szenzitizált élőlény szérumát, vagy antigén specifikus IgE ellenanyagokat juttatnak lokálisan („lokális passzív immunizálás”). Egy két nap elteltével intravénásan juttatnak az állatba antigént, és jelzőfestéket (Evans-blue – albuminhoz kötődik a keringésben) A kisméretű antigén a korábbi oltás helyén kiváltja az IgE hordozó hízósejtek aktivációját. A hisztamin hatására megnő a helyi kapillárisok permeabilitása, a kék festék kijut a szövetbe – kék elszíneződés az oltás helyén

105 Parlagfű (Ambrosia artemisiifolia)

106 levélfonák fehéresen molyhos
Parlagfű (Ambrosia artemisiifolia) Fekete üröm (Artemisia vulgaris) levélfonák zöld levélfonák fehéresen molyhos

107 Fekete üröm (Artemisia vulgaris) – ?
Fehér üröm (Artemisia absinthium) – Abszint Fekete üröm kivonat van az unikumban Az Abszint eredeti fogyasztásmódja: kockacukron keresztül csepegtetett víz opálossá teszi az eredetileg áttetsző zöld folyadékot. A tujon tartalma a fogyasztók lassú elbutulásához vezetett – lásd az arckifejezést az „Abszintivók” képen (Edgar Degas) [dögá] Most 35mg/l-ben maximalizálták.