Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése

Az előadások a következő témára: "Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése"— Előadás másolata:

1 Arabidopsis thaliana tip120 inszerciós mutáns jellemzése

2 Az eukarióta gének csoportjai
I.-5.8S, 18S, 28S rRNS III.-5S rRNS, tRNS II.-fehérjék

3 A transzkripciós iniciációs komplex kialakulása
POLII TFIIF TIP120 TFIIE TFIIH TFIIB TFIIA TBP TATA

4 A TIP120 fehérje néhány jellemzője
1230 AS, szimpla polipeptid Affinitást mutat a TBP-vel és az RNS Pol II Rpb5 alegységével Az iniciációs komplex összeszerelődését serkenti A funkció betöltésében fontos a molekula N-terminális 1/3-a A TIP120 fehérjét kódoló gént kimutatták patkányban, Coenorhabditisban, Drosophilában, emberben, Arabidopsisban

5 Inszerciós mutagenezis
T-DNS LB RB T-DNS inszerció Növényi gén exon/intron promóter 5' UTR 3' UTR Funkcióvesztéses mutáció

6 A H911 vonalban azonosított mutáns
Columbia: normál fenotípus H911/4: apró fenotípus 1

7 Majdnem teljesen steril
A H911 mutáns virágja Columbia: Normál fenotípus H911/4: Majdnem teljesen steril 1

8 T-DNS inszerció pozíciója a H911 vonalban
2. Krom., BAC T8K22 T-DNS inszerció: 13. exon (3301bp) Gén: At2g02560 Protein: feltételezett TBP kölcsönható fehérje (120 kD) (TBP Interacting Protein, TIP120) 1

9 Az Arabidopsis tip120 gén Exon-intron szerkezet: 28 exon
Lokalizáció: 2. kromoszóma, AT2G02560 jelű lókusz Exon-intron szerkezet: 28 exon

10 A H911 vonal szegregációs analízise
LB primer T-DNS H911A H911B 5’ 3’ PCR primerek vad típus heterozigóta homozigóta H911A+B H911B+LB 1500bp 1000bp 750bp 800bp, H911A+H911B 600bp, LB1+H911B Alvonal: Fenotípus: n n n n n n n n a a Genotípus: +/+ +/+ +/- +/- +/- +/- +/- +/ /- -/- PCR analízis eredménye

11 A tip120 gén expressziójának vizsgálata
1. Northern analízis: vad típusú Arabidopsis, illetve apró fenotípusú mutáns totál RNS felhasználásával: nincs detektálható jel. 2. Realtime RT-PCR analízis: tip120 CT értéke: actin kontrol CT értéke: 15.61 tip120 gén expressziós szintje 32x alacsonyabb az actin gén expressziós szintjénél.

12 A TIP120 fehérjét kódoló teljes hosszúságú cDNS klónozása
ATG STOP PCR-amplifikálás (ELONGASE enzim, Invitrogen) BamHI- klónozás pBLUESCRIPT vektorba cDNS- klón: 3990 bp A cDNS szekvenálásának stratégiája TIP5 TIP6 TIP2 TIP1 H911A TIP3 TIP4 BamHI pBS SK+

13 A tip120 cDNS-klón vázlatos térképe
3’ 5’ EcoRI BamHI BamHI SacI T17 EST T17 ATG STOP A tip120 cDNS további klónozása: pAS2 kéthibrid vektor pPCVB1 expressziós vektor

14 Összefoglalás - a H911 mutáns előállítása T-DNS inszerciós mutagenezissel - az apró fenotípust a tip120 génben bekövetkezett homozigóta inszerció okozza - a tip120 expressziója alacsony szintű a tip120 cDNS klónozása pBS, pPCVB1 növényi expressziós vektorba élesztő-kéthibrid rendszer kidolgozása folyamatban van

15 Köszönetnyilvánítás -Dr. Szabados László -Dr. Kovács Izabella
-Dr. Martha Alvarado -Dr. Ökrész László -Zsigmond Laura -Ábrahám Edit -Bíró Anikó -Dr. Maróy Péter -Dr. Boros Imre