Higiéniai kontroll vizsgálatok az élelmiszeriparban

Az előadások a következő témára: "Higiéniai kontroll vizsgálatok az élelmiszeriparban"— Előadás másolata:

1 Higiéniai kontroll vizsgálatok az élelmiszeriparban
A fogyasztásra kerülő élelmiszer mikrobiológiai állapotát befolyásoló tényezők: Nyersanyag Feldolgozás körülményei Tárolási feltételek Fogyasztási szokások Nyersanyag: 1. Kémiai összetétel: zöldség, gyümölcs-magas vízaktivitás-lehetővé teszi a baktériumok gyors szaporodását. húsok: nagy fehérje és CH-át tartalom – sok táplálék a mikrobák számára 2. Biológiai szerkezet: nem teljesen védtelenek. Rezisztencia a növényeknél részben biológiai szerkezetüknek köszönhető: növényi szervek kutikulája, annak viaszbevonata, parásodott szövet, szűk légzőnyílás, magok termések héja bizonyos védelmet nyújt a mikroorganizmusok behatolása ellen. Bizonyos kémiai összetevők is segítenek: sejtfal kovasav tartalma, sejtek szerves sav- és tannintartalma) mikrobaellenes vegyületek: fitoncidok: fokhagymában: allicin, paprikában kapszicidin, mustárban, tormában mustárolaj. Hasonló hatású a gyüm.-ben antocianin, glikozidok (pl paradicsom glükoalkaloidja a tomatin) Állati szervezetnél szintén a biológiai szerkezet bizonyos mértékig útját állja a mikroorganizmusok behatolásának. (bőrszövet, faggyú- és verejtékmirigyek váladéka, nyálkahártyák és a belső szerveket borító hártyák, burkok, izompólyák képeznek védelmi gátakat. Fagocitasejtek, immunnrendszer, ezek kivéreztetésnél eltávoznak, de bizonyos mikrobaellenes vegyületek azonban találhatók az állati eredetű nyersanyagokban. Pl tojásban lizozim, tejben régi szakirodalom szerint lakteninek ma már pontosan tudjuk, hogy laktoperoxidáz tejenzim (tejsavbacik visszaszorítása), lizozim (mikrobák sejtfalának oldása), laktoferrin megköti a vasat, vitaminmegkötő fehérjék, immunglobulinok IgA, IgG, IgM) A bakteriosztatikus / Baktericid fázis időtartama hűtetlen tejben 2-3 óra.

2 4/1998. (XI.11.) EüM rendelet 3. Számú melléklete
Rendeleti háttér 4/1998. (XI.11.) EüM rendelet 3. Számú melléklete Az élelmiszerekkel kapcsolatos tevékenység során használt berendezés, felszerelés, gép, munkaeszköz, élelmiszerrel közvetlenül érintkező munkafelület és csomagolóanyag, valamint a személyi tisztaság élelmiszerbiztonsági mikrobiológiai vizsgálata Mintavétel Megítélés 2.1. Csomagolóanyag 2.2. Felszerelés, munkaeszköz, edényzet, munkafelület 2.3. Személyi tisztaság

3 Az élelmiszer (nyersanyag) és a vele kontaktusba kerülő eszközök, személyek mikrobiológiai terheltségének vizsgálata: A./nyersanyag:  mintavétel  laboratóriumi vizsgálat  eredmény … mikrobaszám/mintaegység B./feldolgozás körülményei: Berendezések felülete (tisztítás-fertőtlenítés után, gyártás előtt…) Levegő (folyamatosan…) Dolgozók (folyamatosan… bőrfelület, ruházat felülete, stb.) C./tárolási feltételek: Csomagolóanyagok felülete (csomagolás előtt…) Makro- és mikroklíma (folyamatosan…) Levegő (folyamatosan…) Tényállás: B. és C. esetben nem vihető közvetlenül minta a laboratóriumba!!!

4 Speciális mintavétel higiéniai kontrollhoz, mikrobaszám detektálásához:
B.1. Felületek esetén a) Indirekt –Kencés (tamponos) :  lemosás  szuszpendálás laboratóriumi vizsgálat (Millipore-Sampler; Biotes-DIP Slide!) eredmény…mikróbaszám/felületegység

5 b) Direkt – Lenyomati kép vizsgálata:
pl. Count-Tact (bioMerieaux – Fr.o.) Hygicult® (Orion Diagn. – Finno.) Biotest Hycon® – Contact slides (Biotest – Németo.) Envirocheck® - Contact slides (Merck – Németo.) CCP pontok ellenőrzése-gyártási folyamatok felületeinek és felszereléseinek mikrobiológiai higiéniai ellenőrzésére. Ezek a lemezek ugyancsak jól használhatók folyadékok mikrobiológiai ellenőrzésére is.

6 Microbial Surface and Liquid Sampling - HYCON® Dip Slides
Vizek mikrobiológiai szennyezettsége Táptalajjal kétoldalt bevont lemez Kinőtt telepek alapján: mikrobaszám/ml folyadék Szimultán meghatározás: Összcsíra, élesztő, penész v. Összcsíra és kóliformok

7 HYCON® Contact Slides Felületek baktérium, élesztő és penész számának meghatározására 25 cm2 kontakt felület Standard, szelektív és egyedi táptalajok

8 Envirocheck® Rodac (Blister) Plates Replicate Organism Detection and Counting
Teljes sejtszám meghatározás Élesztő és penész szám meghatározás Vizsgálat menete: Korong kivétele tasakból Konvex agar felületre nyomása (25g/cm2) 10 mp-ig Jelölés Felület tisztítása Inkubálás szabvány szerint

9 Envirocheck® - Contact slides
A kitt kivétele a tubusból az utófertőződés elkerülése mellett. Szilárd felületek esetében: Felületre nyomás (mindkét oldal)

10 Folyadékok esetében: 5-10 mp-ig folyadékba merítés (teljes kittet). Felesleg leszívatása itatóspapírral. Tesztkitt visszahelyezése a tubusba. Jelölés. Inkubálás előírt ideig

11 Eredmények értékelése az összehasonlító kártya (model density card) alapján
50 %-os (pontosság telepek száma*2)/7

12 Mikroorganizmusok a levegőben
Alapvetően minden porrészecske tartalmaz csírákat, de kizárólag azon fajokat, amelyek a kiszáradást jól elviselik. Ilyenek pl. a mikrokokkuszok, Corynebacterium és Actinomyces fajok, a spóraképzők és a penészgombák. Ezen csírák száma és a porrészecskék száma között bizonyos összefüggés van. Légáramlatok hordozzák őket s ezáltal bejutnak különböző helyiségekbe (közlekedési útvonalakon, takarítási folyamatban…), a felkevert csíratartalmú részecskék órákig lebegnek ott. A por csíratartalma származhat a belső üzemi szennyvízből, a szellőzőrendszerből, az üzem közvetlen környezetéből, mennyisége függ a helyiségben dolgozók számától, azok tevékenységétől és a kiválasztott higiéniai intézkedésektől (védőruházat, haj- és arcvédő…). A levegő átlagos (normális) csíratartalma mikróba m3-enként. A levegő-csíratartalom csökkentésének leghatékonyabb módja az emberek kizárása az üzemi helyiségekből. Ez azt jelenti a gyakorlatban, hogy ki kell zárni az idegenek (részleg, üzem) jelenlétét, különösen a kritikus zónáknál (pl. letöltés). A csíratartalmú belső üzemi szennyvíz aeroszolképződés útján növelheti az üzemi levegő csíraszámát. Az elhanyagolt szellőzőrendszer szintén a magas levegő-csíratartalom forrása. Kiemelt jelentőségű a megnövekedett levegő-csíratartalom az érzékeny termékek letöltésénél, ezért itt speciális védelmi rendszereket kell kiépíteni (steril levegő befúvatás…) a levegőből eredő kontamináció elkerülésére. A különböző tejtermékek előállításánál a javasolt maximális levegő-csíraszám: baktériumok /m3, élesztő-penész /m3.

13 B.2. Levegő mikrobiológiai vizsgálata:
a) Szedimentációs (passzív módszer) – meghatározott ideig nyitva hagyott tápközeg-tartalmú petricsészével) Idő (nyitva)  várható csíratartalom függvénye (kb. 20 perc) Inkubáció  tápközegnek megfelelően Eredmény  mikrobaszám/kb. 60 cm2 + a nyitva tartás ideje b) Beágyazásos (aktív) módszer – a tápközeg felületére fújja a levegőt, max liter Inkubáció  tápközegnek megfelelően Eredmény  mikrobaszám/m3 100 liter/ perc, a mintavétel időtartalma 10 percnél nem lehet hosszabb. pl. egyenesáramú ütköztetéses  MAS 100 (Merck – Németo.) centrifugális ütköztetéses  Standard RCS, RCS Plus (Biotest – Németo.)

14 MAS 100 és MAS 100 Eco (egyenesáramú ütköztetéses)
Élelmiszerelőállító üzemek, kórházak stb. levegőjének vizsgálata MAS 100 Eco

15 MAS 100Ex Szélesebb spektrumú alkalmazás (gázok, magas hőmérséklet) Lamináris áramlás 0.45 m/sec Standard petricsésze Programozható  napi monitoring Kapacitás: l

16 Működési elv Mérés folyamata:
Petricsésze (standard méret) előkészítése Táptalaj késülékbe helyezése Levegőátszívatás beindítása Inkubálás Értékelés a paraméterek alapján (idő áramlási seb. Stb.)

17 SAS Super 100 Baktérium, gomba és vírus detektálására
Különböző méretű táptalajok. Kapacitás180 – 1000 l

18 Microbial Air Samplers - RCS PLUS and RCS PLUS Explosion-Proof (centrifugális ütköztetéses)
Áramlási sebesség: 50 l/min Kapacitás: l speciális tápagar csík

19 Microbial Air Samplers - RCS High Flow
Áramlási sebesség: 1 m3 / 10min Kapacitás: l Hatókör: 10 m

20 Microbial Air Samplers - Agar Media for all RCS Air Samplers

21 Speciális higiéniai kontroll nem mikrobaszám alapján:
 szennyezés maradványok vizsgálata: ATP kimutatás (biolumineszcencia)  Hy-LiteTM (Merck – Németo.) Biotrace Uni-Lite, OPTO-COMP, Systems SURE, LUMAC, Hygiene Monitoring kit Tejfeldolgozás, húsfeldolgozás, konyhák, hűtőházak, ital előállítás, pékség, halfeldolgozó, stb. Baktériumok és más mikroorganizmusok kimutatása Mikrobiális fertőzés, élelmiszer maradvány, állati termék maradvány az öblítővízben, a felületeken, vagy a személyzeten ATP reakció hőmérsékletfüggő hőmérsékletszabályozó(22°C) Tisztítás-fertőtlenítés előtt és után Rövid idő alatt eredmény (60mp.) Gyors adatkezelés Jó érzékenység Az ATP minden élelmiszertörmelékben és sejtmaradványban megtalálható. Az ATP (adenozin-trifoszfát) az a kémiai vegyület, amelyben energia raktározódik valamennyi élő sejtben. Az ATP lumineszcencia vizsgálatban a szentjánosbogár luciferáz enzimje, annak luciferin szubsztrátuma oxigén és magnézium ionok jelenlétében átalakítja az ATP kémiai energiáját fénnyé oxidációs-redukciós reakció keretében. A szentjánosbogarak páratlan reakcióját, a sötétben látható fénykibocsátásukat használja. A kibocsátott fény mennyiség egyenesen arányos a jelenlévő ATP mennyiségével, ily módon a fényegységek felhasználhatók a mintában lévő sejtek biomasszája becslésére. A készülék és megfelelő reagensek segítségével detektálni lehet az ATP mennyiségeket körülbelül 100 baktériumsejt alsó határig, noha ez a gyakorlatban általában közelebb van 10³-104-hez. Az intracelluláris mikrobás ATP mennyiségi értékelése gyors és egyszerűsített extrakciós és vizsgálati módszerekkel végezhető. Az eljárás során emittált fény úgynevezett luminométerrel mérhető. A műszergyártó cégek ellátják a vevőiket minden szükséges reagenst tartalmazó teszt kit-ekkel. A reagenseket a műszerekbe injektálják és a leolvasás relatív fényegységben (RLU-ban) történik. Ismerve a mikroorganizmusok számának és a fényintenzitásnak a kapcsolatát, meg lehet becsülni az élelmiszer mintában lévő mikroorganizmusok számát. Az ATP módszert használják már pl. hús, tej, víz, gyümölcslé, boripari és söripari minták, valamint szörpök mikrobás terhelésének értékelésére (FUNG, 1997). Nagy érdeklődést váltott ki az ATP mérés használata nemcsak az összes élő sejtszám becslésére, hanem mint higiéniai ellenőrzés is, ide értve a felületen lévő szomatikus sejtek jelenlétét is. A felületeken lévő összes ATP kimutatására alapozott ATP bio-lumineszcenciás módszer, a kizárólag mikrobás eredetű ATP mérése helyett, jelzést ad a tisztasággal kapcsolatban, és detektálja a szomatikus eredetű ATP-t is, amit a tradicionális lemezöntéses számlálási módszer nem detektál [CHEN, 2000, ILLSLEY et al., 2000, QUINN et al. 2002, PAEZ et al. 2003]. Ezzel a módszerrel a felületi higiéne megállapítására szolgáló mintákat a felület letörlésével, vagy az öblítő vízből alikvotok vételével lehet nyerni [KISS et al., 1999] A bio-luminométerek leolvasása "elfogadható" vagy "elfogadhatatlan" szintként értékelhető. Bárki, kevés gyakorlattal könnyen elvégezheti az eljárást. Az előkészítési és mérési idő csak néhány percet igényel. Kereskedelmi luminométerek különböző szállító cégeknél rendelkezésre állnak (Biotrace Uni-Lite, OPTO-COMP, Systems SURE, HY-LITE, LUMAC, Hygiene Monitoring kit, stb.) Kaphatók hordozható luminométerek is megfelelő mintavevőkkel és elő-csomagolt reagensekkel. A felhasználó letörli a vizsgálandó felületet, a törlő tampont beteszi a luminométer küvettájában lévő reagens oldatba és megkapja a mérési eredményt. Az ATP bio-lumineszcencia módszer hasznos lehet a higiénével kapcsolatos igen gyors megállapításai miatt, noha a készülék költsége és a gyenge reagens stabilitás még korlátozó tényezőkként szerepelnek.

22 Az ATP biolumineszcencia – mérés elve
(Mg2+) (luciferin-luciferáz-AMP) + pirofoszfát ATP+luciferin-luciferáz (luciferin-luciferáz-AMP) Alapelvek A biolumineszcencia keltésében két enzim játszik szerepet. Az egyik a fotogenáz, amely fehérjevegyületekből a luciferin nevű, a világító szervekben vagy szervezetekben finoman eloszlott anyagot termeli. A luciferin oxigén jelenlétében egy oxidáz, a luciferáz hatására oxiluciferinné oxidálódik, s közben fényt bocsát ki magából. Az oxiluciferin amilyen könnyen oxidálódott, ugyanolyan könnyen redukálható is luciferinné. A luciferin oxidációjakor az összes kisugárzott energia 92 százalékban fényenergia alakjában hagyja el a fénykeltő szervet.    A teszt elve, hogy a mérgező anyag változásokat idéz elő a sejt állapotában - sejtfal, sejtmembrán, az elektrontranszport-rendszer, enzimek, a citoplazma alkotói -, amelyek a biolumineszcencia csökkenésében mutatkoznak meg.    A ToxAlert100 készülék kompatibilis a MSZ magyar szabvánnyal, "A Photobacterium phosphoreum általi fénykibocsátás szennyvíz okozta gátlásának meghatározása" (a Photobacterium phosphoreum a Vibrio fischeri régebbi elnevezése). Ugyancsak kompatibilis az ISO/EN/DIN szabvánnyal. Ipari szennyvizek és elfolyók tesztelésére ajánlott (Pedersen et al., 1995). (O2) Oxiluciferin+luciferáz+CO2+AMP+fény

23 1 2 3 Felületet a mintavevő tamponnal lemosni Tamponra tapadt minta kioldása a regensbe Behelyezés a luminométerbe A vizsgálat hőmérsékletfüggése

24 Élelmiszer/Mikro-biális anyag
ATP mennyisége = baktérium száraz tömegének 0,4%-a --> ÖCSI A vizsgálat elve: luciferin-luciferáz enzimrendszer hatására a mikrobák ATP-je fénykibocsátás mellett reagál. (relatív fénykibocsájtási érték-RLU) Reagens anyag (luciferin és luciferáz) Élelmiszer/Mikro-biális anyag fény

25 Clean Check Program elvén működő ATP meghatározó készülék
Uni-Lite® Xcel Clean Check Program elvén működő ATP meghatározó készülék

26 b) Protein mérés (kolorimetria)  Swab ‘N’Check
(Biotest – Németo.) Az elv hasonló az ATP méréshez, de itt a minta színreakciót ad a reagenssel. Színintenzitás mérésével kapjuk az eredményt

27 klasszikus laboratóriumi analízis kiegészítésére helyszíni mérések
c) Gyorstesztek klasszikus laboratóriumi analízis kiegészítésére helyszíni mérések eredmények gyorsan rendelkezésre (állnak,helyszíni döntéshozás) laboratóriumban is kitűnően alkalmazhatók A gyorstesztek az alábbi minták vizsgálatára alkalmazhatóak: -ivóvíz -talajvíz -felszíni vizek -ipari vizek -élelmiszerek és takarmányok -talaj ás trágya -biológiai minták Laterális áramlás-tesztek (patogének gyors kimutatása élelmiszerekben): E. coli O 157, verotoxinok, Salmonella, Campylobacter és Listeria Ugyanazok a minőségbiztosításai elvek érvényesülnek, mint a klasszikus kimutatási módszernél. Előny: egyszerűen végrehajtható, megbízható eredmény kapható 20 percen belül, jelentős az idő és költségmegtakarítás. Széles termékvűálaszték a tesztek kimutatják a fontos patogéneket az élelmiszerekben: E. coli O 157, verotoxinok, Salmonella, Campylobacter és Listeria

28 Singlepath Negatív Pozitív

29 SOLID PHASE IMMUNOCHROMATOGRAPHIC TESTS
Singlepath gyorsteszt: immunkromatográfiás gyorsteszt, mely arannyal jelzett antitesteken alapul. A teszten 1 kör alakú mintatartó és egy ovális ablak található a teszt és a kontroll számára. Kromatográfiás papirra visszük fel a mintát. A minta abszorbeálódik a reakció zónában, mely kolloid állapotú, arannyal jelzett x fajra specifikus antitesteket tartalmaz. X baci antigénje komplexet alkot az arannyal jelzett antitesttel és a teszt kötő területéig vándorol. A kötő sáv újabb anti-testeket tartalmaz, amelyek megkötik a jelen levő baci-antitest komplexet. Az arany jelzés miatt határozott piros csík képződik. A minta maradvány tovább vándorol egy másik kötő sávba a kontroll zónán belül és itt egy további piros csíkot képez (pozitív kontroll) .

30 Aquamerck® alkalmazási területe rendkívül széles a gyorstesztek praktikus kombinációjából egy adott felhasználási terület igényeinek megfelelő minilabor állítható össze vízanalitikai vizsgálatok (pH, ammónium,nitrit, nitrát, összes keménység, oldott oxigén tartalom) titrimetriás vagy kolorimetrikus elven működnek

31 Reflectoquant® reflektometriás koncentráció mérés analitikai tesztcsíkok és küvetta tesztek reflektometriás kiértékelésével •  ivóvíz •  talajvíz •  felszíni vizek •  ipari vizek •  élelmiszerek (bor) és takarmányok •  talaj és trágya •  biológiai minták (tej)

32 Spectroquant® Fotometriás elven működő készülék Megfelel a GLP szerinti analízis elvárásainak zavarosság okozta eltérés szimultán méréssel korrigálható. Víz-és szennyvíz analitikában Megválasztható, hogy mely paraméterekre és milyen időközönként kívánunk ellenőrző vizsgálatot végezni spektrofotométer nm tartományban spektrum felvétel

33 Merckoquant® Kémiai elemek kimutatására alkalmas tesztrendszer Kimutatható elemek és vegyületek: Alumínium Kobalt Arzén Aszkorbinsav Kálcium Klór Formaldehid Kromát cianid

34 Toxalert élő organizmuskat tartalmaznak (világító baktériumokat) baktériumok fényt bocsájtanak ki (biolumineszcencia) A toxicitás a baktériumok biolumineszcenciájának csökkenésével határozható meg a biolumineszcencia összefügg a sejtmetabolizmussal toxikus anyag megjelenése  sejt állapotában változás  biolumineszcencia csökkenése  fénykibocsátó képesség változása vizek, szennyvizek, folyók, és talajvizek toxicitásának meghatározása

35 Automatizált mikrobiológiai vizsgálati eljárások
Hagyományos séma Mikrobaszám meghatározás: Minta bemérés  homogenizálás  higítási sor  leoltás  inkubálás  értékelés //  megerősítő reakciók (morfológiai, biokémiai)  inkubálás  értékelés Adott mikroorganizmus jelenlét/hiány kimutatása: Minta bemérés homogenizálás  dúsítás (inkubálás)  kioltás  inkubálás  azonosítási reakciók (szerológiai, biokémiai)  inkubálás  értékelés Hagyományos módszerek (pl. lemezöntéses tenyésztés) az élelmiszerben lévő mikroorganizmusok detektálására és számlálására nagy időigényűek (2-5 napot igénybe véve) és munkaigényesek, a patogének detektálása általában elődúsítást, szelektív dúsítást és szelektív lemezre viteli lépéseket majd ezt követően biokémiai és szerológiai megerősítést igényel. Így, nyilvánvalóan szükség van gyors, egyszerű, robusztus és flexibilis technikákra amelyek nem kívánnak olyan speciális szakképzettséget, mint a nehézkes konvencionális módszerek. A hagyományos módszerektől eltérően, gyors, automatizált, különösen a „real time” módszerek lennének alkalmasak a Veszély Elemzés Kritikus Szabályozási Pontok (HACCP) rendszer kritikus ellenőrző pontjainak figyelemmel kiséréséhez.

36 Automatizálási módszerek
Hagyományos műveletek automatizálása Közvetlen mikroszkópos sejtszámlálás Folyadékáramlásos sejtszámlálás Mikroorganizmus bizonyos komponense: baktériumszám Mikroorganizmusok fiziológiai tulajdonsága alapján Antigén-ellenanyag kapcsolat detektálása Azonosítási reakciók

37 1. Hagyományos műveletek automatizálása
A) Rutin laboratóriumi műveletek gyorsítása 1. A minta homogénezésének új módszerei (ultrahang, rázólombik, Stomacher): 2. Az adagolás és a hígítás automatizálása. 3. Az egyszer használatos eszközök alkalmazása (pipetták, Petri-csészék stb.). 4. A leoltási eljárások gyorsítása (anaerob tenyésztés adott gázösszetétel mellett, petrifilm eljárás). 5. A telepszámlálás egyszerűsítése (képanalizátor, lézeres számláló stb.). 6. Spirálmódszeren alapuló szélesztés Előny: előkészítési és telepszámlálási idő csökken Hátrány: inkubációs időt ténylegesen nem csökkenti

38 Automata sejtszámláló berendezés

39 B) A direkt sejtszámlálás újabb módszerei
l. A jó vezetőképességgel rendelkező folyadékban egy kapillárison áthaladva az átmenő áramimpulzusok alapján. /tömeg szerinti osztályozás/ (PICOSCALE, LABORSCALE, FOSSOMATIC). 2. Sejtszámlálás hidrofób hálózatos membránszűrőn át. 3. Fluoreszcenciás és immunfluoreszcenciás mikroszkópiás eljárás 4. Ultrahang echográfia

40 Fossomatic 5000 Sejtek kapillárison történő átvezetése
A kapilláris a mikroszkóp előtt helyezkedik el Az áthaladó sejtek foto-elektromos regisztrálása Citrometriás elven működő készülék Szomatikus sejtszám meghatározás nyers, vagy tartósított tejből

41 Membránszűrők keresztirányú szűrés fordított ozmózisos szűrés mikroszűrés ultraszűrés

42 Direkt epifluorszcenciás szűrési technika (DEFT) -ÖCSI
COBRA, BACTOCOUNT (Direkt immunfluoreszcens technika - patogének) Cobra A vizsgálat menete: A vizsgált organizmusok összegyűjtése közvetlenül a calibrált szűrőn Megjelölés fluoreszcens anyaggal Leolvasás epifluoreszcens mikroszkóppal /vizsgálat folyamatos nyomon követése/ Folyadékáramlásos fluoreszcenciás, vagy lézeres sejtszám meghatározás - ÖCSI, vagy speciális

43 Ellenállás/ vezetőképesség mérése - ÖCSI, vagy speciális BACTOMETER, MALTHUS, RABIT, BAC-TRAC
A vizsgálat elve: a mikrobák szaporodása során bekövetkező ellenállás, vagy vezetőképesség változás mérésén és a mérési görhe elemzésén alapszik.

44 A baktériumos impedancia technika elve
Az impedancia a váltóáramnak a vezető anyagon való átfolyási ellenállása. Ezen módszerek elve a tápközeg ionos összetételében történt változások mérése, ahol a minta mikroorganizmusai által az elektromos töltés nélküli és a gyengén töltött molekulák (poliszacharidok, zsírok, fehérjék) erősen töltött bomlástermékekké (szerves savak, zsírsavak, aminosavak) metabolizálódnak. Ez befolyásolja a közeg elektromos tulajdonságait, amely változást okoz az elektromos vezetőképességben és ellenállásban a folyadékban és a fém elektródák érintkezésénél, amelyek a beoltott szaporító közeget tartalmazó mintatartókban vannak [RICHARDS et al., 1978, RULE, 1997]. Az impedancia vizsgálatot nem befolyásolják a zavaros vagy a nem átlátszó minták, amelyek zavarhatják a lemezöntéses módszernél az alacsony kolónia számok megállapítását.

45 Konduktancia-mérés görbéi
MALTHUS 2000 rendszer: élelmiszerekben lévő baktériumok és élesztőgombák minőségi és mennyiségi meghatározására alkalmas eljárás, amely teljesen automatizált és a konduktancia (vezetőképesség) mérésén alapul. Konduktancia-mérés görbéi A detektálási idő (DT) a teszt kezdete és az impedimetrikus műszer által kiadott gyorsító impedancia jel megjelenése között eltelt időtartam. Impedimetrikus műszereknél, amelyeket mikrobás populációk becslésére fejlesztettek ki, a DT fordítottan arányos az impedimetrikus közegbe beoltott minta mikroba koncentrációjával, mivel minél nagyobb a mikroorganizmusok száma a folyadékban, annál gyorsabb a változás az elektromos impedanciában, kapacitanciában és konduktanciában. A konduktancia az ionok mozgása két elektróda között, a kapacitancia a töltés tárolása az elektróda felületén. Az elektromos jel hőmérséklet függő, így a hőmérséklet szabályozása kritikus: 1 C fokos hőmérséklet növekedés 0,9% növekedést eredményez kapacitanciában és 1,8%-ot a konduktanciában. Az összetételi változások a szaporító közegben sokkal előbb jönnek létre, mint ahogy a kolóniák elérnék látható biomasszájukat a hagyományos lemezöntéses módszernél. Baktériumok esetében, az ionos anyagcsere-termékek összegyűlése akkor válik észlelhetővé, amikor a baktérium szintek kb sejt/ml-t érnek el, vagy élesztő és penész szintek esetén elérik a körülbelül 104/ml szintet A speciálisan összeállított impedimetriás közegek a tradicionális tápközegekénél jobb impedancia görbéket adnak

46 Elektronikus orrok komplex légtérelemzők, amelyek komplex illó metabolitokat detektálnak mérik a feszültség változásokat vagy vibrációs frekvenciákat válaszképpen a mintából emittált illó komponensekre. Képesek jelezni a frissességet vagy, inkább a romlandó élelmiszerek baktériumos rothadását (pl. hűs, baromfi, hal és tejipari termékek, készételek). E technika előnye a gyorsaság és a reprodukálhatóság. Ha egy felhasználási formát már létrehoztak, a rendszert futtathatja minimális képzettséggel rendelkező személy is. A leggyakrabban használt e-orr érzékelők a fémoxid félvezetők (MOS), vezető polimer érzékelők vagy egy kvarckristály mikro-mérleg rendszer. Félvezető fémoxid érzékelők kemiszorbált oxigén speciest tartalmaznak, amely az illó anyagokkal kölcsönhatásba kerülve megváltoztatja az oxid vezetőképességét. A különböző gázérzékelőként preparált vezető polimerek vezetőképessége gyorsan és reverzibilisen megváltozik, ha illóanyagok adszorbeálódnak rájuk. A kvarc-rezonátor érzékelők piezoelektromos kvarckristály oszcillátorból állnak, amely érzékelő membránnal van bevonva. Az illó anyagok adszorpciója a membránon a tömeg megváltozása következtében változásokat okoz a szenzor rezgési frekvenciájában. A mintákat szeptummal lezárt ampullákba helyezik. A műszerben a szeptumot egy tű átszúrja és a mintából az illó anyagok nitrogén áram segítségével átjutnak az érzékelőbe és a mért eredményt tárolják és elemzik. Elektronikus orroknak nevezett kémiai érzékelő készülékek komplex légtérelemzők, amelyek komplex illó metabolitokat detektálnak. Ezek a készülékek különböző típusú érzékelők sorozatából állnak (egészen 32-ig terjedően) és mérik a feszültség változásokat vagy vibrációs frekvenciákat válaszképpen a mintából emittált illó komponensekre. Képesek jelezni a frissességet vagy, inkább a romlandó élelmiszerek baktériumos rothadását (pl. hűs, baromfi, hal és tejipari termékek, készételek). Egy mintafelismerő szoftver rendszer szolgál a minták megkülönböztetésére, és az illó anyagok elektronikus profilozására. Az elektronikus orr valamilyen módon hasonló az emberi szaglási érzékhez (4. ábra). Az érzékelők sorozatának a jelzései összegyűjtésre kerülnek, és komputer segítségével feldolgozzák azokat. Ezeket az adatokat ezután további feldolgozás alá veszik megfelelő szoftver segítségével és az érzékelők válaszait egyetlen „ujjlenyomat”-tá alakítják. Az új minták ujjlenyomatai objektíven összehasonlíthatók a korábban tárolt adatokéval [BARTLETT et al., 1997]. Az elektronikus orr összehasonlíthatja egymással vagy egy referencia standarddal a mintákat. Minőségellenőrzéshez az elektronikus orr kalibrálva van, hogy felismerje az elfogadható és az elfogadhatatlan mintákat. E technika előnye a gyorsaság és a reprodukálhatóság. Ha egy felhasználási formát már létrehoztak, a rendszert futtathatja minimális képzettséggel rendelkező személy is. A leggyakrabban használt e-orr érzékelők a fémoxid félvezetők (MOS), vezető polimer érzékelők vagy egy kvarckristály mikro-mérleg rendszer. Félvezető fémoxid érzékelők kemiszorbált oxigén speciest tartalmaznak, amely az illó anyagokkal kölcsönhatásba kerülve megváltoztatja az oxid vezetőképességét. A különböző gázérzékelőként preparált vezető polimerek vezetőképessége gyorsan és reverzibilisen megváltozik, ha illóanyagok adszorbeálódnak rájuk. A kvarc-rezonátor érzékelők piezoelektromos kvarckristály oszcillátorból állnak, amely érzékelő membránnal van bevonva. Az illó anyagok adszorpciója a membránon a tömeg megváltozása következtében változásokat okoz a szenzor rezgési frekvenciájában. A mintákat szeptummal lezárt ampullákba helyezik. A műszerben a szeptumot egy tű átszúrja és a mintából az illó anyagok nitrogén áram segítségével átjutnak az érzékelőbe és a mért eredményt tárolják és elemzik.

47 Antigén-ellenanyag (immunreakciók) - speciális kimutatása
pl. patogén mikroorganizmusok (vírusok, baktériumok, stb.)

48 Immunológiai módszerek
ELISA, EIA Ensyme Linked Immunosorbent Assay, Ensime Immunoassay ELFA Enzyme Linked Fluorescent Assay RIA Radioimmunoassay FIA Fluorescent Immunoassay IMS Immuno Magnetic Separation Latex agglutináció

49 ELISA: (heterogén enzim-immun vizsgálat) Speciális mikroküvetták salmonella antigénekre előállított monoklonális ellenanyagokkal vannak töltve. A mintában lévő antigén és a kötött ellenanyag között immunkomplex alakul ki, melyhez egy enzimmel jelölt anti-salmonella konjugát kötődik (ellenanyag-antigén-ellenanyag szendvics komplex). Mosás + színképző szubsztrátot --> intenzív kék elszíneződés. Reakció leállítása speciális savas oldattal: kék szín sárgára változik. A keletkezett szín intenzitását 450 nm abszorbanciánál mérjük.

50 Mini VIDAS (ELFA) Eredmények: Elődúsítás, szelektív dúsítás
Vizsgálati minta és a hitelesítő (standard) minta fluoreszcencia értékeinek összehasonlítása --> RFV=Relative Fluorescence Value Összehasonlítás a küszöbértékkel: > v. = küszöbérték: + < küszöbérték: - Elődúsítás, szelektív dúsítás 1-1 cm3 15 min hőkezelés (100°C) 500 µl a mérőcsík első cellájába Vizsgálat: mosás, reakció az enzimmel fluoreszcencia mérés (4-metil-umbelliferil-foszfát)

51 A VIDAS immunanalizátor működési elve
A szubsztrát cirkulál az SPR-ben ki és be A pipettahegy (SPR) felülete specifikus monoklonális antitesttel bevont, s egyben pipettázó funkciót is ellát. Az SPR belső felületén specifikus monoklonális antitest van Meghatározandó mikroorganizmus Az 1. Cellába adagolt minta Egyéb mikroorganizmusok

52 Egymás utáni mosási folyamatok
Mosás utáni maradék Az antitest a mintában jelenlévő antigént megköti

53 Az 5. Cellában van az enzimmel jelzett konjugátum
Több mosási folyamat után a 2. poliklonális antitest hozzákötődik az előzőleg megkötött antigénekhez

54 Alkalikus-foszfatázzal konjugált antitest
„Szendvics” komplex Kromogén szubsztrátum (4-metil-umbelliferil-foszfát Befogott antigén Kötött antitest Egy „szendvics” komplex jön létre, amely az enzim kromogén szubsztrátjával egy fluoreszkáló vegyületet alkot, és ennek a fluoreszcenciáját méri a készülék 450 nm-en

55 Mikroorganizmusok identifikálása automatizált módszerrel:
ATB, VITEK - kolorimetria és/vagy nefelometria ATB Minden kittben 32 biokémiai vizsgálathoz szükséges szubsztátum van Inkubálás (4-24 h) Analízis: kolorimetriás, nefelometriás módszerrel mér. + reakciók alapján egy adatbázisból megmutatja, mely mikroorganizmusról van szó

56 VITEK A készülék tesztkártyája azonosító szubsztrátumokat tartalmaz dehidratált formában Tesztkártya beoltása a vizsgálati mintával és az inkubátor/olvasóba helyezése Az adatok óránként kerülnek kijelzésre

57 VITEK® 2 Baktériumok azonosítása Standardizált inokulumok segítségével Eljárás: Minta higítása az (érzékeny teszt) Kártyák feltöltése az inokulummal Inkubáció Leolvasás (140) Szoftveres kiértékelés Antibiotikum maradvány és fenotípus vizsgálat

58 RIA módszer (Radio Immuno Assay)
Radioaktív anyaggal jelzett antitest Antigén-antitest kapcsolat  radioaktivitás mérés (Jód 125-ös izotópja) Nagy érzékenység Egészségkárosító hatás. Drága módszer. Rövid felezési idő. Gyakoribb kalibrálás

59 FIA módszer (Fluorescent Immuno Assay)
Fluoreszkáló festékkel jelzett antitest Antigén-antitest kapcsolat  fluoreszcens mikroszkóp (UV fény)  sötét látótér Festék: pl.Fluoreszcin izotiocianát Érzékenység: 107 –108 /cm3 Magas költség Szubjektív leolvasás

60 IMS módszer (Immuno Magnetic Separation)
Elődúsítás és dúsítás műveletének gyorsítása Mikrobára specifikus antitest  ferromágneses gyöngyök felületén Gyöngyök hozzáadása az élelmiszermintához/szuszpenzióhoz Mikroba kötődik a gyöngyökön lévő antitestekhez (epitróp csop.) Gyöngyök mágnes segítségével az edény falához Mosás, majd tenyésztés táplevesben Meghatározás: ELISA, vagy ELFA módszerrel

61 Egyéb módszerek C) Sejtalkotók szelektív elemzése
Penészgombák kimutatása kémiai módszerekkel Limulus-teszt  G - mikrobák kimutatása DNS-hibridizációs technika D) Mikroba metabolizmus termékeinek kimutatása Reduktáz próbák (rezezurin-, metilénkék-, nitrátredukciós-próbák) Tejsav, borostyánkősav meghatározás  anyagcsere Kénhidrogén és ammónia kimutatás CO2 mennyiségi meghatározása  anyagcsere Mikrokalorimetria (anyagcsere  hő) Kis C atomszámú zsírsavak  gáz-, vagy folyadék-kromatográfiás meghatározása Latex-agglutináció: latex részecskék(antisavó) + szalmonella