FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ

Az előadások a következő témára: "FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ"— Előadás másolata:

1 FLUORESZCENS IN SITU HIBRIDIZÁCIÓ
Készítette: Hajdu Csilla

2 Módszer elve Fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid próba a sejt morfológiájának változása nélkül bejut a sejtbe, ahol specifikusan köt a komplementer target szekvenciához

3 Alkalmazása Mikroorganizmusok gyors és pontos mennyiségi és minőségi meghatározásra alkalmas Speciális gének expressziójára Morfológiáról, szerkezetről,térbeli elhelyezkedésről ad információt

4 Alkalmazásának előnyei
Látható, de nem tenyészthető mikroorganizmusok vizsgálata Lassan szaporodó, többihez képest metabolikus hátrányban lévő sejtek is detektálhatók, bár a fluoreszcencia intenzitása kisebb Különböző fluoreszcens festékkel egyszerre többféle mikróbaközösség vizsgálható mRNS-ek hibridizálásával bizonyos enzimek termelését végző sejtek detektálhatók

5 Alkalmazásának hátrányai
Lassú anyagcseréjű mikroorganizmusoknál kis intenzitású jelet kapunk Élő és holt sejteket nem tudunk megkülönböztetni Mikroorganizmusok és a környezetük (pl.: talaj) autofluoreszceniiája gondot okoz  speciális szűrők rRNS háromdimenziós struktúrája miatt a hozzáférés nem azonos valószínűségű Festékek fakulása( csökkentése: fakulást gátló anyagok, fotostabil festék: cianin alapú, keskeny sávú filter)

6 Hibridizáció menete 1. A minta fixálása Sejt átjárhatóvá tétele
Sejt épségének fenntartása RNS-ek védelme 2. Speciális mintaelőkészítés, tárgylemezhez rögzítés Sejtek bevonóanyaggal kezelt tárgylemezre cseppentés, majd dehidratáció (alkoholban 50, 80, 100%-os)

7 Hibridizáció menete 3. Hibridizáció
A fluoreszcens festékkel jelölt a komplementer próba mintához adása 4. A nem hibridizált próba eltávolítása mosással 48°C-os mosópufferrel, jéghideg csapvízzel mosás, majd szárítás 5. A minták értékelése mikroszkóppal Keskeny sávú filterrel felszerelt hagyományos mikroszkóppal, kamerával a képek digitalizálása

8 Fluoreszcens festékek
Fluoreszcein származékok (pl.: fluoreszcein izotiocianát) Rhodamin származékokj(pl.: tatrarhodamin izotiocianát) Cianin származékok: Cy3 – rRNS-hez kötődik, gerjesztés: 550 nm, emisszió: 570 nm DAPI – DNS-hez kötődik, gerjesztés: 358 nm, emisszió: 461 nm RNS-hez is kötődik: emisszió kb.: 400 nm

9 Hibridizált Escherichia coli

10 Hibridizált Escherichia coli

11 DAPI-val festett Trichosporon cutaneum

12 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni
Saccharomyces cereviciae Bacillus subtilis Trichosporon cutaneum

13 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni
Trichosporon cutaneum Bacillus subtilis

14 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni
Bacillus subtilis Trichosporon cutaneum Saccharomyces cereviciae

15 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni
Trichosporon cutaneum

16 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni
Saccharomyces cereviciae Trichosporon cutaneum

17 Ezeket a sejteket fogjuk megfesteni