DNS amplifikáció pl . DNS szekvenálásnál nagy jelentősége van

Az előadások a következő témára: "DNS amplifikáció pl . DNS szekvenálásnál nagy jelentősége van"— Előadás másolata:

1 DNS amplifikáció pl . DNS szekvenálásnál nagy jelentősége van
(egy DNS szakasz sokszorosítása - amplification) pl . DNS szekvenálásnál nagy jelentősége van sejten belül (in vivo) pl. E. coliban sejten kívül (in vitro) Készítette:N.P.

2 Sejten kívüli DNS sokszorosítás
használták az E.coli DNS polimerázát is az áttörést azonban a hőstabil DNS polimeráz (Taq) hozta, ami a Thermus aquaticus -ból származik

3 PCR (polimeráz láncreakció)
A PCR egy automatizált DNS sokszorosító, amit az amerikai kutató Kary Mullis fejlesztett ki a 80-as években Ennek kifejlesztését a Taq polimeráz tette lehetővé, mivel megnövelte a PCR hatékonyságát

4 A PCR-hez szükségesek hőstabil DNS polimeráz (Taq)
templát DNS a cél szekvenciával dATP, dCTP, dGTP,dTTP reverse és forward oligonukleotid primerek Mg2+ ion a polimeráz enzim aktivitásához pH stabilizáló puffer (Tris-Cl) és KCl

5 A PCR ciklikusan működik
Elődenaturáció 2 perc 95 °C A denaturáció során a dupla DNS szál ketté válik ez 95°C-on s-ig tart A primerek kötődnek a DNS szálakhoz 3’ irányba, ez kb °C-on s-ig tart A szintézis során a polimeráz enzim 3’-5’ irányba kb nukleotid/perc sebességgel dolgozik, s 72-78°C-on Ezt a ciklust pl. 30-szor megismétli az automatizált termosztát és millió számra felszaporítja a cél szekvenciánkat 72°C-on 10 perc lánchosszabbításért