Labor beszámoló M2 csoport

Az előadások a következő témára: "Labor beszámoló M2 csoport"— Előadás másolata:

1 Labor beszámoló M2 csoport
Elválasztás technika Labor beszámoló M2 csoport Bartus Zsuzsanna Fodor Melinda Mahunka Marietta Marosi Dóra Németh Viktória Szabados Ádám Szabó Dávid Takács Mónika Troczkis Fruzsina

2 HS-GC-MS

3 HS-GC-MS PerkinElmer HS-GC-MS
Gőztéranalizátor (headspace) – mintaadagolás Gázkromatográf – elválasztás Tömegspektrométer - detektálás

4 Gőztéranalizátor (HS) - mintatartó
Minta (folyadék, szilárd)- és Gázfázis közt egyensúly alakul ki Az egyensúly eltolódását a gőztér hőmérséklet változtatásával (termosztálás) tudjuk befolyásolni Egyensúly beállta után véges térfogatot bocsájtunk a gázkromatográfba

5 Kiegyensúlyozott nyomású mintaadagolás (balanced pressure)
d=0,2-0,3 mm, kicsi holttértfogat, elhanyagolható zónaszélesítő hatás Minta térfogat nagysága a ∆p-től és adagolási időtől függ Zárt, minden részében jól termosztált rendszer Paraméterek könnyen kontrolálhatók, jól reprodukálható mérések

6 Gőztéranalizátor – beállítandó paraméterek és főbb hatásaik
Gőztér hőmérséklete (max 400°C): megoszlási hányados Termosztálási idő: megoszlási hányados Tű hőmérséklet: kondenzálás Átvezető cső hőmérséklete: kondenzálás Nyomás alá helyezés ideje: mintatérfogat, kapilláris Injektálási idő: mintatérfogat

7 Gázkromatográfia Kromatográfia: fizika-kémiai elválasztási módszer, ahol az elválasztandó alkotók 2 fázis közt – álló és mozgó – oszlanak meg a különböző mértékű kötődéseik szerint Gázkromatográfia: gáz halmazállapotú mozgófázis Kolonna töltete/belső bevonata lehet az állófázis Gázok és gőz halmazállapotúra hozható folyadékok vizsgálatára alkalmas Az elválasztás nagyszámú szorpciós-deszorpciós lépésen keresztül történik Az elválasztás függ a vivő gáztól (Hidrogén, Nitrogén, Hélium) MS-nél Héliumot alkalmaznak a nagy ionizációs energiája miatt

8 Gázkromatográfia Két kolonna típus: Elválasztás befolyásolása:
töltött kolonna: töltet lehet szilikagél, aktív szén, diatómaföld…stb., 2-4 mm belső átmérő, 0,3-3 m hossz kapilláris kolonna: belső folyadék film bevonat lehet metil-szilikon olaj, fenil-metil-szilikon olaj…stb., 0,10-0,53 mm belső átmérő, m hossz Elválasztás befolyásolása: Termosztáló hőmérséklet Hőmérséklet egyenletes, lineáris változtatása Állófázis változtatása

9 Tömegspektroszkóp Mérés elve: ionos részecskéket választunk el fajlagos tömegük (töltésegységre eső tömegük: m/z) szerint csökkentett nyomáson elektromos vagy mágneses mezők segítségével Mérjük az elválasztott ionok intenzitását Tömegspektrum (ujjlenyomat) Minőségi információ: legintenzívebb ion intenzitásra normált karakterisztikus tömegspektrum

10 Legfontosabb készülékelemek
Mintabeviteli rendszerek (GC-MS) Ionforrás Analizátor Detektor Számítógép Vákuumrendszer Energiaellátó elektromos egységek

11 MS detektor

12 Előnyök összetett elegyek minőségi és mennyiségi elemzése rövid idő alatt (20-30 perc) elvégezhető, s igen kis mennyiségű alkotók ( g) meghatározása lehetséges Minőségi,szerkezeti információ (hogyan?): Referencia anyagot kell használni a mérés során kapott tömegspektrum és ismert vegyületek, ismert tömegspektrumainak az összehasonlítása, a mérés során kapott tömegspektrum "megfejtése", ismert szabályok alapján történő értelmezése

13 Scanfunkciók Pásztázó: SID:
az egész m/z tartományra történő ionintenzitás mérés A különböző m/z pontoknál mért intenzitások egymáshoz való arányát is lehet látni → minőségi információ Dinamikus üzemmód,pillanatnyi ionáramot mér,nagyobb hibával jár SID: Különböző, kevés m/z pontokban történő ionintenzitás mérés Legalább 2 pontban kell mérni Az adott mérések csak pár m/z pontra korlátozódnak, így a kérdéses ionokról sokkal pontosabb mérési eredményeket kapunk → mennyiségi információ Kimutatási határ 1 nagyságrenddel jobb

14 FID (lángionizációs detektor)
kb K hőmérsékletű hidrogén-levegő láng A lángban a C-H kötéseket tartalmazó molekulák, azaz a szerves vegyületek (pl szerves savak) fragmentálódnak és egy részük ionizálódik Láng fölé helyezett elektródpár között gyenge áram folyik ionok képződésének hatására jel (feszültséget mér) (mintakomponens koncentrációjával arányos) Standardek használata

15 HS-GC mérésgyakorlat Mérés célja:
Melaszban lévő karbonsavak vizsgálata. Vizsgált minták: C2, V2 Felhasznált vegyszerek: 85%-os foszforsav, NaCl (Merck, Darmstadt), több komponensű kereskedelmi standard (minden komponens 10 mmol/l)

16 Gőztéranalizátor (HS) paraméterei
Minta hőmérséklete: 60 °C Tű hőmérséklete: °C Átvezető cső hőmérséklete: 150 °C Termosztálási idő: 10 perc Nyomás alá helyezés ideje: 2 perc Injektálási idő: 0,05 perc Tű visszahúzás ideje: 0,5 min

17 Gázkromatográfiás készülék adatai
Készülék: Perkin Elmer AutoSystem XL Detektor: FID Vivőgáz: N2, 110 kPa Adagoló: Perkin Elmer Headspace Sampler HS 40 Kolonna: VOCOL 60m x 0,53 mm x 3 μm Hőmérsékletprogram: 50 °C – ról 200 °C – ig 7 °C/perc sebességgel

18 A standardek és a minták előkészítése
Légmentesen záródó 20 ml-es üvegedénybe bemértünk 2g NaCl-ot (kisózás), majd 1 ml foszforsavat adtunk hozzá. Erre mértük rá automata pipettával a standard/minta 1 ml-es részletét. Közvetlenül ezután az edényt gyorsan légmentesen lezártuk.

19 Standard kromatogramja

20 C2-es minta kromatogramja

21 V2-es minta kromatogramja

22 Mérési eredmények A C2-es mintában azonosított komponensek:
propionsav, izovajsav, izovaleriánsav, izokapronsav, kapronsav A V2-es mintában azonosított komponensek: propionsav, izovajsav, vajsav, izovaleriánsav

23 GyorsLC

24 Kromatográfia általánosan
Többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus elválasztási módszerek gyűjtőneve. Közös elem: az elválasztandó komponensek az egymással érintkező két fázis között oszlanak meg, ezek közül az egyik áll, a másik pedig meghatározott irányba halad.

25 UHPLC (UPLC) HPLC p<400 bar Dp= 3-10 µm, porózus, nem porózus
L= cm; 3-8mm 5-200 µl UV-VIS 8x, 10x gyorsabb p› bar Dp‹2-3 µm; héjszerű szemcse L= 3-10 cm; 2-3 mm 0,1-0,5 µl minta térf. UV-VIS

26 Alapösszefüggések a kolonnán kívüli zónaszélesedésre optimált gyors LC és HPLC módszereknél
Kis szemcseátmérő Kis térfogat (kisebb holttérfogat, kisebb komponens hígulás) Elemzési idő csökk.: L csökk., u növelése (k nem- interferencia veszély)  meg kell növelni p-t (Darcy)

27 Szemcse sérülése (UHPLC nagyobb nyomás)
Kis η mozgófázis  acetonitril tartalmú (gradiens elúció, maximumos görbe) H csak kis mértében nőjön u-val (függ η) Készülék max nyomás  sebességnövelés határa Nagy nyomáshőhossz-, keresztirányú hőm.-grad. széles torzult csúcs (belső átmérő csökk.) belső átmérő csökk.Vr csökk. külső zónaszélesítő hatások

28 Kromatográfia kinetikus elmélete:
van Deemter egyenlet: H- elméleti tányérszámmal ekvivalens oszlopmagasság, u-mozgófázis lineáris áramlási sebessége A: az oszlop geometriájának hatása (szemcsék közti tér nem teljesen rendezett) B: longitudinális diffúzió (molekula áramlik a szemcsék között) C: anyagátadással szembeni ellenállás

29 Kromatográfia kinetikus elmélete:
Szemcseátmérő csökkentése: élesebb csúcs, rövidebb, kisebb átmérő

30 Kromatográfia kinetikus elmélete:
Hőmérséklet növelésével:csökken a kölcsönható erők viszkozitása (mozgófázis), nő a mérendő komponens diffúziós állandója. B≈DM (molekuláris diffúziós állandó); C≈ (póruson belüli diffúziós állandó) Kis szemcsén belüli átmérő, a mozgófázis áll, csak a részecske diffúzióját vizsgáljuk.

31 Kromatográfia kinetikus elmélete:
Nyomás növelése: a szemcseátmérő csökkentés velejárója, lamináris tartomány Héjszerkezetű állófázis: a diffúziós úthossz rövidebb, mint egy teljesen porózus szemcsénél. Kolonna ellenállását csökkenteni, mozgófázis gyorsabb, nem töltetes, hanem monolit kolonna esetén. Egy nagyságrenddel kisebb nyomás, mint a porózus töltet esetén. Könnyebben alakul ki nagyobb sebesség. Nyomástartomány és az oszlopon kívüli térfogat nagyon fontos.

32 UPLC készülék paraméterei
Waters Acquity, Ascentis Express Peptide ES 10 cm x 3 mm; 2,7 µm (0,5 µm tömör belső) Gradiens elúció Eluens (30 % B-ig mentünk fel): A: víz+0,1 % TFA; B: acetonitril:víz+0,1 % TFA (= 90:10) U=0,8 ml/min, beinj.: 2 µl, Detektálás: λ=260 nm

33 Mérés kiértékelés Mennyi komponenst tud meghatározni?
Pc=1+tg/wb (tg= 2.5 min alatt)  Pc= 41

34 Korlátok a gyors folyadékkromatográfiás módszereknél

35 Korlátok a gyors folyadékkromatográfiás módszereknél
Azt vizsgáljuk, hogy milyen követelmények vannak műszer oldalról nézve az elemzés gyorsaságának növelésére. A kromatogramon mért zónaszélesedés két fő részből tevődik össze: Kolonna által okozott Kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások Adagoló okozta zónaszélesedés σ2A Összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2Ö Detektorcella okozta zónaszélesedés σ2Dcell Detektor elektronika okozta zónaszélesedés σ2Dt σ2E = σ2A+σ2Ö+σ2Dcell+σ2Dt ∑σ2= σ2C+ σ2E

36 Az adagolóban és az összekötő vezetékben azért van zónaszélesedés, mert az
áramlás lamináris és a sebességi profil parabolikus, az egyes rétegek közötti keveredés elhanyagolható. Azok a molekulák, amelyek a cső falához közelebb vannak kb fele sebességgel haladnak, mint a maximumban lévők => áramlási csúcsdiszperzió Ehhez hozzájárul a detektorban az áramlási sebesség megváltozása: ha lassú az elektronika, akkor nem lehetséges legalább 20 adatpont gyűjtése, amiből a kromatográfiás csúcs analóg jele leképezhető =>változik a görbe alatti terület és a zónaszélesség. A zónaszélesedés összege nem lehet nagyobb, mint a kolonnán mért tizede. σ2E=0,1σ2C

37 Példa UPLC: 5 cm hosszú, 2,1 mm belső átmérőjű kolonna, 1,7 µm szemcseátmérőjű töltet Kolonna okozta zónaszélesedés: σ2k=(πr2εT)2HL UPLC: σ2k=8,14 µm A komponens hígulása a kolonnán kicsi és a csúcskapacitás nagy, mert szűk a zóna, viszont a kolonnán kívüli zónaszélesedést meghatározza. A 10 %-os szabályt betartva a kolonnán kívüli zónaszélesedésnek 1 µl alatt kell lennie. Ez pedig több függetlenből tevődik össze, meg kell adni az egyes tagok járulékait: - megengedett legnagyobb injektált térfogat Vinj=105 nl - Detektor okozta zónaszélesedés és detektor térfogat σ 2det=20,8 µl - összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2Ö=1,28 µl*1280 nl - detektor időállandó τRC=0,17 sec r=2,1 cm εT=0,5 Dp=1,7 µm H= 3,4 µm L=5 cm

38 Mintavételezési sebesség hatása a csúcskapacitásra és a felbontásra: a csúcskapacitás összefügg a kromatográfiás felbontással, így ha a csúcskapacitás csökken, csökken a felbontás is. Mintavételi sebesség Csúcskapacitás 80 Hz 40 Hz 20 Hz 10 Hz 5 Hz 61 56 44 28 16 HPLC A lassú mintavétel jelentősen csökkenti a kromatogramon látható csúcsok számát 80 Hz 40 Hz 20 Hz 10 Hz 5 Hz 2,25 2,05 1,71 1,17 0,67 UHPLC A gyors kolonnák nagy mintavételi frekvenciát igényelnek A kis belső átmérőjű és rövid kolonnákhoz a hagyományos HPLC rendszer nem, vagy csak nagy hatékonyság csökkenéssel alkalmazható.

39 Rövid kolonnák alkalmazása HPLC rendszerben: - 5 µl jelenti az adagolás felső határát - a minta oldószerének gyengébbnek kell lenni, mint a mozgófázis eluenserőssége - a molekuláris formának azonosnak kell lennie a mintában és a mozgófázisban - az összekötő vezetékek hosszát a készülék által megadott minimumra kell csökkenteni Adagoláskor a kolonna elején csúcskompresszió történik => gradienselúciót alkalmazunk akkor is, amikor nem lép fel az általános elúciós probléma. A kiindulási mozgófázis összetételének olyan gyengének kell lennie, hogy a minta leggyengébben visszatartott komponensének is nagyobb kell, hogy legyen a visszatartása, mint 10. Visszatartási tényező: K= KVs/Vm=ns/nm*Vs/Vm Vs, Vm: álló- és mozgófázis térfogata K: megoszlási hányados ns, nm: álló- és mozgófázisban mért mólok száma

40 k>10 A komponensek döntő részben az állófázisban tartózkodnak
k>10 A komponensek döntő részben az állófázisban tartózkodnak. Az összes komponens vándorlási sebessége lecsökken, a mintaadagolás során a kolonna eleje koncentrálja azokat. Vándorlási sebesség [ux=u/(1+k)] csökken. k=10 Tizenegyed részére csökken a vándorlási sebesség, így a komponensek szűk zónában koncentrálódnak. Itt problémát okozhat az oldhatóság, ha a minta komponenseinek nagyon eltérő az apolaritása vagy polaritása. Ekkor a jobban visszatartott komponensek a gyenge eluenserősségű mozgófázisban kevésbé oldódnak. A közel egyforma tulajdonságú vegyületeknél a szelektivitás csökken.

41 Az elválasztást befolyásoló paraméterek hatásának vizsgálata

42 A kromatográfiás felbontás alapösszefüggése
Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k) N az elméleti tányérszám (kinetikai hatékonyság), α a relatív retenció vagy szelektivitás (termodinamikai hatékonyság), k a visszatartási tényező. A kromatográfiás rendszerekben az elválasztás ezen három paramétertől függ.

43 Hogyan befolyásolja a paraméterek megváltoztatása az elválasztást?
Deriváljuk az elválasztást megadó Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k) összefüggést, mindig az adott vizsgálandó paraméter (N, α, k) szerint.

44 1.) Elméleti tányérszám hatása
ΔRs/ΔN = 1/8(N½)(α-1/α)(k/(k+1)) Egységnyi N változás  0,0144% elválasztás- változás. Ha a kolonnahosszat 2x-esére növeljük (pl. N = ről 6000-re)  az elválasztás értéke kb. 14%-kal nő (ha ua. a kolonna és változatlan a mozgófázis összetétele). Ez a hatás kismértékű, tehát a kolonnahossz növelése csak mérsékelten növeli az elválasztást. A nyomásesés a kolonnán közben kétszeresére nő. Ezek az adatok k = 2-3, α = 1,1 és ΔR = 1 körüli értékekre igazak.

45 Van Deemter  ha a szemcseátmérőt felére csökk
Van Deemter  ha a szemcseátmérőt felére csökk.  az elméleti tányérmagasság is a felére csökken (Hmin és az Nmax)  N 2x-esére nő. A H-u görbe meredeksége annál kisebb, minél kisebb a szemcseátmérő (N-ben nagyobb lesz a nyereség). Ha 3 µm-ről 1,5 µm-re csökkentjük az állófázis szemcseátmérőjét, akkor pl. N= ra nő  kb. 26%-os növekedés az elválasztásban (ha az egyéb paramétereket változatlanul hagyjuk). A nyomásesés 4x-esére nő!

46 2.) Szelektivitás hatása
ΔRs/Δα = ((N½)/4)(1/α2)(k/(k+1)) Egységnyi változás az α-ban  közel 1000-szeres változást okoz az elválasztási tényezőben. A szelektivitási tényező kismértékű változása nagymértékben növeli az elválasztást. Folyadékkromatográfiában vagy az állófázis típusát változtatjuk meg (állófázis hatás), vagy a mozgófázis összetételét (mozgófázis hatás). Ahhoz, hogy a mozgófázissal a megfelelő elválasztást tudjuk elérni, szükséges, hogy az állófázison minimális elválasztás elérhető legyen. A vegyületek szerkezetének függvényében, tehát az első feladat a legnagyobb szelektivitást nyújtó állófázis kiválasztása, csak utána következhet a mozgófázissal az elválasztás „finomhangolása”.

47 3.) Visszatartási tényező hatása
ΔRs/Δk = ((N½)/4)((α-1)/α)(1/(1+k)2) Egy egységnyi változás k-ban  kb. 8% változást jelent a felbontásban. A deriváltnak maximum helye van a 2-3 k érték körül. Folyadékkromatográfiában a visszatartást az állófázis minőségével, a mozgófázis összetételével és a hőmérséklettel tudjuk változtatni.

48 Hőmérséklet Új elválasztást befolyásoló tényező, amely a technikai megvalósításban a legutóbbi években jelent meg.

49 Monolit kolonnák

50 Elemzési idő csökken, ha a lineáris áramlási sebesség nő!
tr=L/u(1+k) Szemcsés tölteteknél a lineáris áramlási sebesség növelésével egyenes arányban nő a kolonnán a nyomásesés Ez monolit kolonnákra is igaz, viszont ezeknek az áramlási ellenállásuk sokkal kisebb, mivel porozitása a szemcsés töltethez képest sokkal nagyobb (a kolonna térfogatának 80%-a holttérfogat) Azaz ugyanolyan áramlási sebességhez sokkal kisebb nyomásesés tartozik (~ 1 nagyságrenddel)

51 Monolit töltet elektronmikroszkópos képe
Vannak szilikagél és szerves polimer alapú monolitok. Szerves alapúnál a mikropórusosság elkerülhetetlen, ami szélesebb kromatográfiás csúcsot eredményez, valamint ezek mechanikailag kevésbé stabilak (biopolimerek elválasztására alkalmazzák). Fehér rész: szilikagél alapváz (benne nm-es mezopórusok; visszatartást eredményezik) Sötét rész: nagy átmérőjű pórusok (1-2 μm; mozgófázis áramlás itt)

52 Az elválasztási ellenállás

53 Térfogatáramlási sebesség és nyomásesés a kolonnán
Tehát nyomásesés szempontjából a monolit előnyösebb, mint a szemcsés. Az általánosan alkalmazott 1-2 ml/min térfogatáramlási sebességek 6-9 ml/min értékre növelhetők.

54 Előnyök és hátrányok Előnyök: Hátrányok:
Térfogatáramlási sebesség növelhető Az elválasztás hatékonysága csak kis mértékben csökken gyors elválasztáskor Hagyományos készüléknél alkalmazható Gyors elválasztások közül ez adja a legkisebb elválasztási ellenállást Elemzési idő csökkenthető a térfogatáramlási seb. programozásával Hátrányok: A kolonna felületi kémiája korlátozott- elsődlegesen oktadecil és oktil módosított kolonnák kaphatók, és a normál fázisú kromatográfiában alkalmazott alap szilikagél Mivel műanyag házban van a töltet, így max bar nyomás alkalmazható

55 Köszönjük a figyelmet!