Előadást letölteni
Az előadás letöltése folymat van. Kérjük, várjon
KiadtaSarolta Jónásné Megváltozta több, mint 10 éve
1
1 OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA 2011 1.1. Fotodinamikus terápia (VT), szept. 21. 1.2. Fotokróm anyagok (BP), szept. 28. 1.3. Fluoreszcencia-mikroszkópia (VT), okt. 5. 1.4. Festékpróbák az anyagtudományban (KM), okt. 12. 1.5. Cirkuláris dikroizmus spektroszkópia (KM), okt. 19.
2
2 ALAPISMERETEK (vizsgára, doktori szigorlatra átismételni) Kémiai anyagszerkezettan V. OPTIKAI SPEKTROSZKÓPIA (Optsp05) VI. A MOLEKULÁK FORGÓMOZGÁSA (Forgo05) VII. A MOLEKULÁK REZGŐMOZGÁSA (Rezgo05) VIII. A MOLEKULÁK ELEKTRONSZERKEZETE (Molel05) X. LÉZEREK, LÉZERSPEKTROSZKÓPIAI MÓDSZEREK (Lezer05)
3
3 Festékpróbák Abszorbeáló próbák Fluoreszkáló próbák
4
4 Reichardt’s dye
5
5 „charge transfer” festék C. REICHARDT, Chem. Rev. 94, 2319-2358 (1994)
6
6 A Reichardt-festék abszorpciós színképe 90 %-os (m/m) glicerin-víz elegyben (GW), ionos folyadékban (IL), acetonitrilben (ACN) és diklórmetánban (DCM). K.A. Fletcher, Green Chem. 3, 210-215 (2001)
7
7 S0S0 = 810 nm Ph-O-Ph = 453 nm H 2 O S1S1 Oldószer polaritás
8
8 skála Az oldószer polaritását jellemzi.
9
9 Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől
10
10 Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől Etanolban + 78 C max = 568 nm - 78 C max = 513 nm
11
11 Szolvatokromizmus: a szín függ az oldószertől Termokromizmus: A szín függ a hőmérséklettől Etanolban + 78 C max = 568 nm - 78 C max = 513 nm Piezokromizmus: A szín függ a nyomástól Etanolban 1 bar max = 547 nm 10 kbar max = 520 nm
12
12 Festékpróba CD-spektroszkópiai alkalmazása
13
13 Példa biológiai CD vizsgálatra: DNS vizsgálata akridin naranccsal AN Az AN interkalációs komplexet képez
14
14 AN – DNS rendszerek CD spektruma a hozzáadott DNS mennyiség függvényében D. Fornasiero, J. Phys. Chem. 85, 613 (1981) exciton felhasadás
15
15 A fluoreszcencia-mérés előnyei az abszorpcióméréssel szemben 1. Nem kell átlátszó minta 2. Nagyobb érzékenység 3. Háromszoros szelektivitás - gerjesztési hullámhossz szerint - emissziós hullámhossz szerint - lecsengési idő szerint Hátrány: a vegyületeknek csak kis hányada fluoreszkál
16
16 Fluoreszcens festékpróbák J. R. LAKOWICZ, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Edition, Kluwer Academic, London, 1999
17
17 O N N N C 2 H 5 C 2 H 5 C 2 H 5 C 2 H 5 + ClO 4 - Oxazin 1
18
18 Oxazin 1 UV-látható abszorpciós spektruma
19
19 Oxazin1 + receptor
20
20
21
21 Spektrofluoriméterek -stacionárius - időfelbontásos ( F mérése, időkorrelált egyfoton-számlálás)
22
Vázlat 22 Műszerek stacionárius spektrofluoriméter időkorrelált egyfoton-számlálás Statikus kioltás dinamikus kioltás oldószer polaritás / hőmérséklet / viszkozitás hatása Lippert-egyenlet vibrációs relaxáció Oldószer relaxáció kettős fluoreszcencia feherjék fluoreszcenciája / triptofán FRET rotációs diffúzió (orientációs relaxáció)
23
23 Stacionárius
24
24 Időkorrelált egyfoton-számlálás
25
25 Fluoreszcencia lecsengési görbe
26
26 Statikus kioltás
27
27 Oxazin1 + receptor
28
28
29
29
30
30
31
31 Dinamikus kioltás
32
32 Lakowicz, p. 461
33
33 Lakowicz, p. 461
34
34 M + h M + M + Q M*M*
35
35 A dezaktiválódás sebessége és fluoreszcencia-hatásfoka Kioltó nélkül Kioltóval
36
36 Stern-Volmer egyenlet
37
37 Oldószer polaritása és hőmérséklete
38
38 S0S0 S1S1 Oldószer polaritás
39
39 S0S0 S1S1 vibrációs relaxáció 10 -12 s oldószer relaxáció oldószer relaxáció 10 -10 s abszorpció 10 -15 s emisszió 10 -9 s
40
40 Polaritás hatása: Lippert-egyenlet + _ - - + + 2a G v. E
41
41 Lippert-egyenlet + _ - - + + 2a G v. E
42
42 Naftilamin-származékok Stokes eltolódása Lakowicz, p. 191
43
43 Prodan Lakowicz, p. 200 Ikerionos gerjesztett állapot, spektrum eltolódás a polaritás függvényében
44
44 Patman C CH 3 (CH 2 ) 14 O CH 3 2 2 N(CH 3 ) 3 + A Prodan lipofilizált + ionos változata
45
45 Lakowicz, p. 199
46
46 400 500 IFIF [nm] Lakowicz, p. 199 -Oldószer relaxáció sebessége kisebb, ha csökken a hőm. - a sáv -30 C-on a legszélesebb: kettős fluoreszc.
47
47 Kettős fluoreszcencia DMANCN fl. Színképe etilénglikolban Lakowicz, p. 201
48
48 Acrylodan N O H H H H 3 C CH 3 Hidrofób festék, zsírsav-megkötő fehérje vizsgálatára használják
49
49 Zsírsavkötő fehérje működésének vizsgálata Lakowicz, p. 202 FABP = fatty acid binding protein Titrálás zsírsavval (oleát)
50
50 Fluoreszkáló aminosavak fenil-alanin tirozin triptofán
51
51 Triptofán abszorpciós és emissziós spektruma (víz, pH 7) Lakowicz, p. 446
52
52 Lakowicz p. 453 A triptofán környezetének hatása fehérjék fluoreszcencia spektrumára 1)Apoazurin Pfl 2)T1 ribonuklease 3)staphillococcus nuclease 4)glucagon
53
53 Rezonancia energia-átadás (Förster resonance energy transfer = FRET) Távolságmérés fluoreszcenciával! Mikroszkóppal a hullámhossztól függő, UV- fénnyel ~ 200 nm-es felbontás érhető el FRET: 2-10 nm-es távolságok érzékelhetők
54
54 Donor festék – akceptor festék, D fluoreszc. tartománya átfed A absz. tartományával.
55
55 Ha D és A távolsága kicsi, FRET, D-t gerjesztve az A fluoreszkál A hatás 1/r 6 -nal arányos
56
56 Példa: DNS –foszfolipid kölcsönhatás vizsgálata C. Madeira, Biophys. J. 85, 3106 (2003)
57
57 Akceptor Donor: EtBr (etidium bromid)
58
58 EtBr abszorpció BODIPY fluoreszcencia
59
59 Fehérjék konformáció-változását lehet FRET-tel követni
60
60
61
61 Festékmolekula orientációs relaxációja + _ - - + + 2a G v. E
62
62 Hidrodinamikai súrlódás járuléka Stokes-Einstein-Debye egyenlet
63
63 Dielektromos súrlódás járuléka
64
64 Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán Habuchi et al., (Sapporo), Anal. Chem. 73, 366-372 (2001) Gyanta: sztirol - divinilbenzol kopolimer Keresztkötések gyakorisága ( ) 8 % divinilbenzol Ioncserélő csoport: Na-szulfonát
65
65 Níluskék festék fluoreszcenciája ioncserélő gyantán
Hasonló előadás
© 2024 SlidePlayer.hu Inc.
All rights reserved.