MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI

Az előadások a következő témára: "MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI"— Előadás másolata:

1 MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI

2 MUTAGÉN Az emberi szervezetre, annak természetes és mesterséges környezetéből nagyszámú toxikus tényező fejtheti ki hatását, melyek egy része a sejtek genetikai állományát is károsítja! Egyik lehetséges mód: MUTÁCIÓ Watson és Crick 1953: DNS kettős spirálszerkezetének és önreprodukciós képességének kimutatása

3 DNS kettős spirál szerkezete

4 Szemikonzervatív replicatio: DNS sejtosztódás előtti megkettőződése
Szemikonzervatív, mert az egyik lánc az eredeti DNS molekulából származik a másik újonnan szintetizálódik DNS replicatio során létrejöhetnek „hibák” mutációk következő megkettőződéssel továbbadódik, ha nem keletkezik ellentétes mutáció (reserv) Mutáció a genom megváltozása Gyakorlati szempontból: pontmutáció, kromoszóma aberratio A legtöbb mutáció spontán és váratlan

5 DNS-molekula szemikonzervatív replicatioja

6 Benignus polimorfizmus
A kimutatott mutációnak ‘nincs’ klinikai relevanciája Genetikai értelemben akkor használjuk, amikor olyan mutációt takar, amelyek genetikailag még nem mutathatók ki azon egyéneknél akiknél a klinikai relevanciák megtalálhatók Kockázati mutáció A betegség kialakulását nem okozza, de a betegség kialakulásához hozzájárul a jelenléte

7 Mutáció szűrési módszerek
A mutáció szűrési eljárások során keressük a betegséget / szindrómát okozó mutációt, vagyis a mutáció elváltozás / betegség kapcsolatot derítjük fel! Linkage analízis: Eltérő DNS polimorfizmusokat keresünk a beteg és a kontroll DNS-ében Ismert mutáció kimutatása: annak eldöntésére végezzük, hogy az illető a kérdéses megbetegedésben szenved-e, vagy annak kockázatát hordja-e a génszerkezetében Ez a leggyakrabban használt eljárás A betegségért felelős mutáció keresése:Keressük az adott betegségben szenvedők adott génjében azokat a mutációkat, amelyek csak a betegeknél mutathatók ki

8 A betegségért felelős mutáció(k) keresési stratégiája
A gén adott szakaszait PCR reakcióval amplifikáljuk Az így nyert DNS-ben mutáció szűrési eljárásokkal mutációt keresünk A mutációt nukleotid szekvencia analízissel azonosítjuk Vizsgáljuk, hogy a talált mutáció benignus polimorfizmus, vagy betegségért felelős mutáció Vizsgáljuk a mutáció hatását a DNS szekvenciára, aminosav összetételre, fehérje szerkezetre

9 Mutáció szűrési eljárások
DGGE: Denaturáló grádiens gél elektroforézise TGGE: Hőmérséklet grádiens gél elektroforézise SSCP: Egyszálú DNS konformációs változatai Heteroduplex analízis CFLP:Heteroduplexek vágása 1.Kémiai módszerrel történő vágás 2.Enzimatikus módszerrel történő vágás 3.Speciális enzimmel történő vágás Mismatch binding proteinek kötődésén alapuló eljárás PTT

10 TGGE: Hőmérséklet grádiens gél elktroforézise

11 SSCP: Egyszálú DNS konformációs változatai

12 A mutáció azonosítása nukleotid szekvencia analízissel
1.A kérdéses gén szakaszról PCR segítségével másolatot készítünk 2.A PCR azonosságát és tisztaságát ellenőrizzük 3.Nukleotid szekvencia meghatározás 4.A szekvenálást mindkét irányból el kell végezni 5. A mutáns és kontroll szekvenciájának összehasonlítása

13 PCR: polimeráz láncreakció

14 Heterozigóta mutáció kimutatás PCR-SSC, nukleotid szekvencia analízissel
Pedigre PCR-SSCP analízis Heterozigóta mutáns szekvencia Vad nukleotid szekvenciája

15 PCR-SSCP

16 Felhasznált irodalom:
Dr. Papp Zoltán: Klinikai genetika DE-OEC: Alapvető Molekuláris Biológiai Módszerek (Debrecen 2003.) Kép: Internet Készítette: Kolocsán Tünde Biológia-környezetvédelem II. évfolyam Nyíregyháza, November 13.

17 KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!