Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító.

Az előadások a következő témára: "Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító."— Előadás másolata:

1 Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

2 REKOMBINÁNS ANTITESTEK ÉS A PHAGE DISPLAY TECHNIKA Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Csősz Éva Molekuláris terápiák – 7. előadás

3 A 7. fejezet célja, hogy bemutassa a terápiák során felhasznált antitestek termelésének lehetőségeit és korlátait. A fejezet során bemutatásra kerül az antitestek termelődésének folyamata, a terápiás antitestek termelése hibridómákban illetve a nagyfokú antitest diverzitás biztosítása fág diszplay segítségével. A 7. fejezet témakörei 7.1. Áttekintés 7.1.1. Az antitestek szerkezete és termelődése a szervezetben 7.1.2. Antigén – antitest kölcsönhatás 7.2. A terápiás antitestek termelése 7.2.1. Antitestek termelése hibridómákban 7.2..2. Humanizált antitestek 7.2.3. Humán antitestek termelése 7.3. Antitestek termelése fág diszplay segítségével 7.3.1. A fág diszplay technika bemutatása 7.3.2. Fág könyvtárak készítése 7.4. A terápiás antitestek alkalmazása TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

4 Nehéz lánc: konstans régió, variábilis régió Könnyű lánc: konstans régió, variábilis régió Hinge régió Szupervariábilis régió Diszulfid hidak COO - NH 3 + VHVH VHVH VLVL VLVL C H3 CLCL CLCL C H2 C H1 F ab régió Fc régió Az antitestek szerkezete TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

5 V H1 V H2 D Hn D H1 V Hn V H4 V H3 J H1 CC CµCµ J Hn J H3 J H2 C  CC C α J H2 D H1 V H4 C  IgG Nehéz lánc kb. 85 génkb. 27 génkb. 6 gén Az antitestek nehéz láncának szerkezete TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

6 VL1VL1 VL2VL2 VLnVLn VL4VL4 VL3VL3 JL1JL1 CC JLnJLn JL3JL3 JL2JL2 JL3JL3 VL2VL2 CC kappa könnyű lánc kb. 35 kappa génkb. 5 kappa gén kb. 30 lambda gén kb. 4 lambda gén Az antitestek könnyű láncának szerkezete TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

7 B sejt Antitest Az antitestek termelése a B sejtekben TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

8 Rekombináció Kapcsolódási diverzitás Szomatikus hipermutáció B sejt Antigén/epitóp Plazma sejt Specifikus antitest BCR Y Y Y Y B sejt Klonális szelekció Klonális expanzió A klonális szelekció és klonális expanzió TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

9 Y Y Y Y B sejt Antitest Antigén Epitóp Antitest Poliklonális antitestek TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

10 B sejt Antigén Epitóp Antitest Monoklonális antitestek TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

11 Lépsejtek izolálása HGPRT Antitest termelés Mielóma sejtek HGPRT  Antitest termelés  Egér immunizálása Antigén Lépsejtek és mielóma sejtek fúziója, a hibridóma sejtek létrehozása Hibridómák szűrése és szaporítása Antitestek izolálása Y Y Y Y Y Y Y Antitestek termelése hibridómákban TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

12 Egér antitest Humán antitest Humanizált antitest / kiméra antitest Humanizált antitestek TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

13 Egér immunoglobulin gén Humán immunoglobulin gén Humán vagy humanizált antitestek termelése Humán antitestek termelése génmódosított egerekben TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

14 5 db p9 5 db p7 5 db p3 5 db p6 2700 db p8 DNS - 6.4 kb M13 bakteriofág E. coli 900 nm Az M13 bakteriofág szerkezete TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 F-pilus

15 Immobilizált fehérje / affinitás mátrix Specifikus elúció Az immobilizált fehérjékhez kötött fágok specifikus elúciója TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

16 mátrix Enzim fág diszplay TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

17 mátrix Szubsztrát fág diszplay I. TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

18 mátrix Szubsztrát fág diszplay II. TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

19 mátrix Enzim-szubsztrát fág diszplay I. TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

20 mátrix Enzim-szubsztrát fág diszplay II. TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

21 Fágmid Rekombináns fágmid Változatos szekvenciák sokasága Fág könyvtárak készítése TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

22 hGH génProteáz szubsztrátM13 gIII gén Fágmid vektor hGH gén Proteáz szubsztrát M13 gIII gén Fágmid vektor Változatos szekvenciák létrehozása Fág könyvtár Proteáz szubsztrát szekvencia Proteáz szubsztrát fág könyvtár készítése TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

23 hGH receptor mátrix Proteáz Alacsony pH Proteáz rezisztens szekvenciák Proteáz érzékeny szekvenciák Szekvenálás Proteáz Szubsztrát fág diszplay – proteáz hasítóhelyek fejlesztése TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

24 Fág könyvtár beadása intravénásan A fágok az erek falán expresszált fehérjékhez kötődnek Biopszia A kötődött fágok lemosása A kötődött fágok szaporítása A fágok által hordozott peptidek/fehérjék azonosítása In vivo fág diszplay – ér endothel sejtek térképezése TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

25 Limfociták mRNS cDNS Antitest specifikus primer Teljes vér (Immunizált donor) Antitest génekFágmid E. coli sejtek 10 8 különböző antitest génjét tartalmazzák Antitest könyvtárak készítése teljes vérből TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

26 Y Y Y Y Y Y Y Tumor sejt Ölő sejt (NK sejt vagy monocita) Tumor ellenes antitestek Fc receptor Antitest függő citotoxicitás mechanizmusa TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

27 TNFalfa IL2 receptor alfa lánc Transzplantáció utáni szervkilökődés megakadályozására, főként veseátültetések esetén Pszoriázis Reumatoid arthritisz Crohn betegség Spondilitisz Humán-egér kiméra antitest Monoklonális antitestek Adalimumab Infliximab Golimumab Cetrolizumab pegol Basiliximab Immunszupresszáns hatású terápiás antitestek alkalmazása TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

28 Bispecifikus antitest (kb. 300 kDa) IgG - scFv (Fab – scFv) 2 A terápiás antitestek változatai TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

29 Fv Tandem scFvDiabodyTriabody Bispecifikus antitest F(ab’) 2 Fab scFv S-S scFv 2 dsFv S-S Nanobody A kisméretű terápiás antitestek változatai TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011