Immunrendszer sejtjeinek jellemzése és elválasztása

Az előadások a következő témára: "Immunrendszer sejtjeinek jellemzése és elválasztása"— Előadás másolata:

1 Immunrendszer sejtjeinek jellemzése és elválasztása
Áramlási citometria, FACS poliklonális limfocita aktiválás

2 Figyelmeztetés A diasorozat „bő lére van eresztve”. Az ábrák jelentős része (pl. sok áramlási citometriával kacsolatos dia) nem része a „törzsanyagnak” csak érdekességként, háttérinformációként szolgál!

3 Az immunrendszer sok sejttípusa (pl
Az immunrendszer sok sejttípusa (pl. a különféle limfociták) morfológiailag nem megkülönböztethetők egymástól

4 HUMÁN LIMFOCITAPOPULÁCIÓK FONTOSABB SEJTFELSZÍNI STRUKTÚRÁI

5 Az immunrendszer sejtjeinek jellemzése sejtfelszíni antigének* alapján
A sejtfelszíni markerek alapján jellemezhető a sejtek funkcionális állapota is (nyugvó/aktivált) és diagnosztikus értéke is lehet a sejttípusok jellemző százalékos arányának megváltozása, rendellenes sejtfelszíni markerek megjelenése, egyes markerek mennyiségének megváltozása, eltűnése esetén. Példák: „Aktiválási markerek” megjelenése (CD69 (limfociták), CD83 (DC)) haematológia neoplasticus folyamatok diagnosztikája, csontvelői érési zavarok HIV progresszió/AIDS manifesztációja: CD4+ helper T sejtek számának csökkenése (CD4+ : CD8+ = 1.6, Normál CD4+ T-sejt szám = 600 – 1400/l) AIDS = CD4+ T sejt szám <200/l! CD5+ B sejtek felszaporodása – B sejtes leukémiák egy része (* az immuniológusok gyakran az immunválasz szemszögéből viszonyulnak különféle anyagokhoz, ezért gyakran megesik, hogy ott ahol mások a „molekula”, „receptor” vagy „fehérje” kifejezéseket használnák ott az „antigén” szót találjuk. Mivel ezeket az anyagokat gyakran ellenanyagok segítségével fedezték fel/mutatják ki, a terminus használata helyénvaló)

6 CD antigén sejttípus funkció ligand
T sejtek T sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4 helper T sejtek, plazmacitoid dend-ritikus sejtek (pDC), monociták T sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC-II, HIV CD5 T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8 citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejtek) T sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14 Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19 B sejtek CR2 része, B sejt antigénreceptor koreceptora C3d, C3b CD28 kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34 hematopoietikus progenitor sejt, endotélium sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56 NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152 A megbeszéltek vannak megemlítve és egy két olyan ami említésre kerül ebben az anyagban. LPS – lipopoliszaharid LBP – lipopoliszacharid kötő fehérje CR2 – komplement receptor 2 (liganduma: C3d és C3b) (A C3d a C3b-ből keletkező fragment. Nem enzimaktív, de az opszonizáláshoz jobb mint az eredeti)

7 Az immunrendszer sejtjeinek elválasztása Kétféle megközelítés:
Cél: a számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból. Elvi alap: a sejtek valamely a többitől eltérő tulajdonságát kihasználva történik a szétválasztás (amennyiben ez a különbség kihasználható!) fizikai – sűrűség, méret sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre immunológiai – eltérő sejtfelszíni antigének Eredményt jellemzi: tisztaság és kinyerés (avagy visszanyerés) hatékonysága Kétféle megközelítés: pozitív szeparáció – a kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitől negatív szeparáció – a nemkívánatos sejtek megjelölése & eltávolítása (depléció)

8 Ficoll-Paque/Percoll sűrűség alapú sejtszeparáció
perifériás vér vékony pipettával a sejtek alá töltött Ficoll mononukleáris sejteket tartalmazó „gyűrű” átpipettázása centrifugálás szeparált, tisztított sejtek plazma ficoll vvt-k mononukleáris sejtek (MNS, PBMC) vérlemezkék granulociták

9 (from Google pictures)
(Nature Protocols

10 (RosetteSep™, StemCell Technologies)
Rozetta képzést felhasználva a Ficoll szeparáció felhasználható a nem kívánatos sejtek eltávolításához is, melyeket vvt-hez kötünk (RosetteSep™, StemCell Technologies) A az eltávolítandó sejtre, és a vvt specifikus ellenanyag azonos típusú. A sejtekből és ezekből, erre az ellenanyagra specifikus második ellenanyag nagy komplexeket hozhat létre (rozetta). A vvt-k így magukkal viszik ezeket a sejteket is. Lehet ilyen negatív szeparációs kiteket kapni!

11 Az adherens sejtek kinyerése vagy eltávolítása
Olcsó, egyszerű, de csak az adherens sejtek elválasztására alkalmas, és alacsony tisztaságú

12 Ellenanyag ”panning” kitapasztott ellenanyagok

13 Komplement mediált lízis
ellenanyagok komplement LÍZIS A vörösvérsejtek enyhén hipotóniás ammónium-klorid pufferben lizálhatóak, ellenanyag és komplement nélkül is!

14 Egyszerű mágneses sejtszeparálás
Fagocita sejtek apró vasszemcséket képesek fagocitálni, ezután egy erős mágnessel elválaszthatóak más sejtektől Mágneses sejtszeparálás (MACS 1.) specifikus ellenanyag paramágnesesség – nem mágneses anyag, ami mágneses térben maga is mágnesessé válik (pl. vas) paramágneses gyöngy („bead”)

15 MACS 2. AZ ELVE HASONLÓ AZ IMMUNSZORBENS TECHNIKÁHOZ

16 jelölt sejtek kinyerése
Mágneses sejtszeparálás (MACS 3.) MÁGNES oszlop Nem jelölt sejtek kinyerése (negatív szeparáció), vagy eltávolítása (depléció) jelölt sejtek kinyerése (pozitív szeparáció)

17 Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas
Áramlási/áramlásos citometria Az immunofluoreszcens módszerek közé tartozik, a felhasználás lehetőségek jelentős része a monoklonális technikán alapul. Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas Folyékony közegben, nagy sebességgel áramló egyedi sejteket vizsgál A fluoreszcens festékkel jelölt sejtek által kibocsátott fény intenzitását és a sejtek fényszórását detektálja Morfológiai adatokat csak közvetetten szolgáltat (méret, granuláltsági állapot) Statisztikai jellegű módszer FELHASZNÁLÁS: A klinikumban immunológiai és haematológiai diagnosztika, kis százalékban jelenlevő sejtek vizsgálata. A kutatásban széleskörű felhasználás a sejtek életképességének mérésétől a kromószamaanalízisen át a sejtelválasztásig.

18 Sok izomer létezik, ezek fény intenzitása kissé eltér egymástól!
Fluoreszcens jelzőanyagok 1. Fluoreszcein, FITC (fluoreszcein izotiocianát) Ez két dia arról, hogyan néznek ki ezek az anyagok. Gyorsan át lehet szaladni rajtuk. A bal oldalibb görbe a gerjesztö fényé (kisebb hullámhossz nagyobb energia), a jobb az emisszióé. fluoreszcein-5-izotiocianát Sok izomer létezik, ezek fény intenzitása kissé eltér egymástól!

19 Fluoreszcens jelzőanyagok 2.
Fikoeritrin, PE 3Z-fikoeritrobilin (PEB) kromofór csoport Az ábrázolt tetrapirrol lánc a fikoeritrin(PE) kromofór csoportja. A fluoreszcens PE egy fehérje, ezzel a kromofór csoporttal. A bal oldalibb görbe a gerjesztö fényé (kisebb hullámhosszú nagyobb energia), a jobb az emisszióé. A fikoeritrin különféle algák fotoszintetikus apparátusában a klorofill ”alá dolgozó” fehérje

20 Fluoreszcens jelzőanyagok 3.
Kívánalmak a festékekkel szemben minél nehezebben kioltható fluoreszcencia (fotostabilitás) minél szűkebb excitációs és emissziós spektrum (több „szín” együttes használhatósága miatt) Új generációs festékek Előnyös kioltási és spektrális tulajdonságok „egzotikus” spektrális tartományok használata: UV (Pacific Blue®), infravörös - IR (PE-Cy7, APC-Cy7) Tandem festékek: energiaátadás a két komponens között, nagy eltérés lehet az excitációs és emissziós spektrum között (akár extrém „Stokes-shift”-ek is, pl. PE-Cy7) Jellemzőbb képviselők: APC, AlexaFluor® család, Dyomics DY-xxx, Pacific Blue®, TexasRed ®, PE-TexasRed ® Tandemek: BD Cy-chrome® (=PE-Cy5), PE-Cy7, Cy5.5-PerCP, APC-Cy7

21 A citométerek fejlődése a korai sejtszámláló berendezésektől a sejtválogató „szorterekig”
©J.Paul Robinson A citométerek fejlődéséről néhány gyorsan végigfutható kép Early cell counter. Katherine Williams and C.S. Sanders (Atomic Energy Research Establishment) Unclassified in (Photo taken in Science Museum, London UK)

22 asztali áramlási citométer (BD FACSCalibur™)
Ezt benne lehetne hagyni, hiszen ilyesmikkel találkozhatnak majd Itt is az alsó a mienk (is) szorter-áramlási citométer (FACS, BD FACSDiVa™)

23 A lamináris áramlás lehetővé teszi a sejtek gyors vizsgálatát
a: eritrociták a lamináris folyadékáramban egyenletesen rendeződve és kissé elnyúlva haladnak a hirodinamikai erők hatására a központi áramlat mentén b: turbulens áramlásban a sejtek deformálódnak és a cső fala mentén szétszórtan, különböző sebességgel haladnak a folyadékárammal (v>3 m/s) A mérés gyakorlati lehetősége ezeken az elveken alapul. A lamináris áramlás lehetővé teszi az egyes sejtek egymás utáni mérését, még nagy áramlási sebesség esetén is. Turbulens áramlásban a különböző pozíciókban elhelyezkedő sejtek ”össze-vissza” szórják a fényt – használhatatlan. Image fromV. Kachel, et al.

24 (hidrodinamikai fókuszálás)
Lamináris áramlásban a tinta vékony sugárba rendeződve áramlik az elvezető csövön keresztül (hidrodinamikai fókuszálás) A tinta elvezető-csőbeli elhelyezkedését alig befolyásolja az eredeti pozíciója Lamináris áramlásban a sejtek egy keskeny sávba ”terelődnek”, így az oda fókuszált optikával jól vizsgálhatók/megvilágíthatók. V. Kachel, H. Fellner-Feldegg & E. Menke

25 A citométer hidrodinamikai rendszere
vivő- vagy köppeny folyadék Áramlási cella Injektor Fluoreszcens szignálok Fókuszált lézer sugár vivő folyadék + + + minta akár 6-10m/s sebesség Így valósítják meg a lamináris áramlást a gyakorlatban. A sejteket tartalmazó folyadékot („minta”) enyhe többletnyomás nyomja a köppenyfolyadék áramlásába.

26 Előre irányuló fényszórás
A mért paraméterek: Fényszórás (FSC, SSC) Előre irányuló fényszórás Lézer bármely részecskéről (”sejtméret”) FALS Sensor FSC (forward angle light scatter, forward scatter) Az előre irányuló fényszórás detektorába a lézer fénye közvetlenül azért nem jut be, mert vagy nem teljesen előtte helyezkedik el, vagy egy kis fémlemez kiárnyékolja a direkt lézerfényt. A fény a hullámhosszhoz hasonló méretű struktúrákon minden irányba szóródik, a nagyobbakról inkább az eredeti irányának megfelelően halad tovább. Ezért kék az ég, és piros a nyugvó nap (apró páracseppek szétszórják a kék fényt), és az oldalszórás ezért jellemzőbb az apró granulumokkal teli sejtekre. 90-os (oldal) fényszórás kisebb struktúrákról (organellumok, sejtfelszín) 90LS Sensor SSC (side scatter)

27 nagy érzékenységű fotodetektorok (fotoelektron sokszorozók – PMT
A mért paraméterek: Fluoreszcencia Lézer FALS Sensor FSC nagy érzékenységű fotodetektorok (fotoelektron sokszorozók – PMT photon multiplayer tubes) fluoreszcens festékek vagy autofluoreszcencia (piridinek és flavinok jelenléte miatt)

28 Az áramlási és az optikai rendszer elvi felépítése
fényérzékelők spec. tükrök és fényszűrők PMT 4 vizsgálandó sejtek PMT 3 áramlási cella PMT 2 Dikroikus tükrök: csak egy adott hullámhosszóság alatti vagy feletti fényt áteresztő a többit tükröző tükör. Ferdén elhelyezve a megfelelő színű fény leválasztható a többiről. Sávszűrők: adott hullámhossz tarrományú fényt áteresztő, a többit elnyelő „klasszikus” fényszűrők. PMT – fotoelektron sokszorozó (photomultiplayer tube) FSC érzékelő PMT 1 Lézer(ek)

29 A jelölés az elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul
Immunfenotipizálás Pl.: a CD4+ (helper) és a CD8+ (citotoxikus) T sejtek arányának Meghatározása perifériás vérben A jelölés az elsődleges antigén-ellenanyag kapcsolódáson alapul Jelölő anyagok: FITC jelzéssel ellátott anti-CD4 ellenanyag (α-CD4-FITC) PE jelzéssel ellátott anti-CD8 ellenanyag (α-CD8-PE) Azért az NK sejteken is lehet (valamennyi) CD8 Th NK Tc B A perifériás vérben jelenlévő limfociták egy részéhez specifikusan kötődik a megfelelő ellenanyag

30 nagy sebességű folyadékáram detektálása (CD4-FITC)
Th nagy sebességű folyadékáram (küvettában, vagy szabadon) A FITC jelölt (TH) sejt detektálása (CD4-FITC) jelfeldolgozó egység Képernyő detektor CD8 PE Fókuszált lézernyaláb A CD4+ CD8- sejtet szimbolizáló pont CD4 FITC

31 CD8 PE CD4 FITC Tc A PE jelölt (Tc) sejt detektálása (CD8-PE)
jelfeldolgozó egység detektor CD8 PE CD4 FITC

32 B CD8 PE CD4 FITC A jelöletlen sejtek detektálása (pl.B)
jelfeldolgozó egység detektor CD8 PE CD4 FITC

33 kvadráns statisztika 18% 0% CD8 PE 44% CD4 FITC 38%
A statisztikai adatok mérés közben is megtekinhetők 44% CD4 FITC 38%

34 Ábrázolásmódok 1. dot-plot contour- plot density- plot („pseudocolor”)
A „plot”-ok a különféle sejtek százalékos megoszlása bemutatásának eszközei. A klasszikus dot-plotban egy-egy pont egy-egy sejtet reprezentál. Normál vérben is előfordulnak kis mennyiségben CD4+/CD8+ duplapozitív sejtek! Az enyhén CD8+ sejtek valószínűleg NK sejtek.

35 Ábrázolásmódok 2. - Hisztogram
A hisztogramm felfogható egy oldalról megtekintett kontúrplotként is. A hisztogrammokkal is lehet százalékos megoszlást bemutatni, de inkább a „festődés” mértékének összehasonlítására való egyes minták közt

36 A különböző sejttípusoknak jellegzetes fényszórásuk van
granulociták oldal irányú fényszórás - SSC (granuláltság, a sejtek komplexitása) monociták Perifériás vér mononukleáris sejtjeinek fényszórása (a vizsgálatot zavaró eritrociták elötte lizálva lettek) Látható, hogy a granulált sejteknek milyen nagy az oldalszórásuk (SSC). A granulált sejtek előre irányuló szórása(FSC) is nagyobb a granulálatlanoknál, de kevésbbé nyilvánul meg az oldalszóráshoz képest. Az FSC nagysága ezért csak hasonló granuláltságú sejteknél jellemző a méretre. limfociták előre irányuló fényszórás - FSC („méret”)

37 A vérminta vörösvérsejt mentesítéséhez használt módszer
befolyásolja a megmaradó sejtek százalékos összetételét az eritrociták lizálásával kapott eredmény sűrűség alapú elválasztással kapott eredmény (Ficoll) hiányzó granulociták

38 A ”kapuzás” segítségével az egyes populációk külön-külön jellemezhetők (gating)
limfociták granulociták összes sejt monociták granulocita „kapu” monocita „kapu” A granulociták CD4 „expressziója” autofluoreszcencia vagy az FcR-ok általi aspecifikus kötődés következménye – csak kontroll ellenanyaggal összehasonlítva szabad kimondani valamiről, hogy pozitív limfocita „kapu”

39 De vannak problémás esetek is!
Az előző ábrával kapcsolatban felmerülhet, hogy honnan lehet megállapítani, hogy egy adott sejt valóban specifikusan jelölődött-e vagy az autofluoreszcencia miatt látszik jelöltnek? A CD4 jelölés a limfociták esetében egyértelmű volt a helyzet, mert a + és – populáció egyszerre volt jelen, és a CD4+ limfociták könnyen elkülöníthetőek a CD4- limfocitáktól. De vannak problémás esetek is! Pl. CD1a, MHC szerű molekulát expresszáló dendritikus sejtek arányának meghatározása Honnan számítanak a sejtek pozitívnak?

40 ? Összehasonlítás egy festetlen kontrol mintával (vagy izotípus kontrol ellenanyaggal „jelölt”) humán CD1a specifikus, egér IgG1 „kontrol” egér IgG1 ellenanyag (pl. DNP specifikus) DNP = dinitrofenil (haptén). Az ellene termeltetett ellenanyagok nem valószínű, hogy az emberi sejteken bármit is felismernének. Hol húzzuk meg a határt?

41 A hisztogrammos ábrázolásmód sok esetben megtévesztő lehet
Együtt ábrázolva a specifikus festődést egy más hullámhosszon mért autofluoreszcenciával: autofloureszcencia IgG1 izotípus kontroll ellenagyag CD1a autofluoreszcencia Az izotípus kontroll ellenanyaggal „jelölt” minta segítségével kijelölhető a várt CD1a+ sejtek helye A hisztogramm elfedi ezeket a sejteket DNP = dinitrofenil (haptén). Az ellene termeltetett ellenanyagok nem valószínű, hogy az emberi sejteken bármit is felismernének. A hisztogrammos ábrázolásmód sok esetben megtévesztő lehet

42 NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56)
Szorter-áramlási citométerrel (FACS) elvileg bármely detektálható populáció kiválasztható, és elkülöníthető Például: NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) NK sejtek NKT sejtek limfociták

43 Az áramlási cellát rezegtetve a folyadéksugár
cseppekre bontható (bennük a sejtekkel) töréspont A rezgés piezoelektromosságon alapul. Ultrahang frekvenciájú ( kHz). Azonos frekvenciával megvilágítva (stroboszkóp) a rezgésenként képződő cseppek állni látszanak (lásd az ábrát). A cseppképződési pontot befolyásolja a rezgés frekvenciája, amplitúdója, a folyadékáram sebessége, stb. (4-5 cseppenként 1 sejt)

44 - - - - - - - - - + + + + Lézer vibráló áramlási cella +
Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp-képződési pontot, a folyadéksugárra arra az időre elektromos töltés kapcsolódik, így a leváló csepp töltötté válik. A folyadéksugár cseppekre szakad - + - + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + + + - + + + - A lézeres detektáláshoz képest a töltés bekapcsolását ennek megfelelően időben annyival később végzi a berendezés, amennyivel később a folyadékáramban levő sejt eléri a csepp-képződés helyét (”drop-delay”). Ez a késleltetési idő, ismerve frekvenciát, a megvilágítás és a csepp-képződési pont közötti távolságot, és a cseppek távolságát (azaz a ”cseppképződés hullámhosszt”) kiszámolható, és a berendezésen beállítható. - - - - - Gyűjtőcső Gyűjtőcső

45 Sejtek fenotípusa mellett a sejtek állapota/funkciója is vizsgálható
A sejt anyagcseréjének intenzitását jelezheti a benne levő mitokondriumok száma - ez a mitokondriumokat specifikusan festő anyagokkal kimutatható. A sejtek nukleinsav mennyisége kimutatható a nukleinsavakhoz sztöhio-metrikus mennyiségben kötődő festékekkel. Ilyen, a duplaszálú nuklein-savakba (DNS v. RNS) interkalálódó festék: propidium jodid ethidium bromid N+ C2H2)3 NH2 C2H5 CH3 Propidium N+ C2H5 NH2 Ethidium

46 A sejtciklus vizsgálható a DNS mennyiség alapján
DNA Analysis G1 G0 G1 s Count s G2 M Ha egymáshoz tapad 2db G0/G1 sejt (pl. Az osztódás után, vagy a SLAM miatt  ), akkor a méréskor úgy látszanak mintha G2 –ben lenne egy sejt. Ez az artefaktum az ún. doublet-discrimination módszerrel kizárható. A sejt áthaladási idejét méri a lézeren: a dupla sejtnek kétszer annyi idő kell. Ez alapján kikapuzható. 2N 4N 200 400 600 800 1000 DNA content

47 A typical DNA Histogram
DNA Analysis A typical DNA Histogram szub G0/G1 sejtek PI – propidium jodid; szub G0/G1 sejtek – fragmentálódott DNS-ű apoptotikus sejtek (lásd később) 200 400 600 800 1000 2N 4N PI Fluorescence

48 normál sejtciklusú sejtek
A sejtciklusra jellemző (intracelluláris) fehérjék megjelenésének a kimutatásával (ellenanyagokkal) további lehetőségek nyílnak a sejtciklus, és az osztódó sejtek kimutatására: Ciklinek, Ki-67, PCNA Apoptózis kimutatása: DNS mennyiség csökkenése alapján Nukleoszómák közötti DNS hasítás során keletkező DNS végek jelölése: BrDU avagy dUTP és Tdt (terminális deoxinukleotidil transzferáz) A sejtmembrán normális esetben intracelluláris oldalán levő foszfatidil szerin molekulái megjelennek az extracelluláris oldalon. Fluoreszceinnel konjugált Annexin V jelölés szub G0/G1 sejtek normál sejtciklusú sejtek Ki-67 – osztódó sejtekben expresszálódik, nem tudom tudni-e a funkcióját PCNA – Proliferating Cell Nuclear Antigen (nem szigorúan sejtosztódás specifikus, mert a DNS sérüléskor/hibajavításnál is expresszálódhat) dUTP (BrDU – bromo deoxi uridin) –t a fragmentált DNS szabad végeihez(3’ vagy 5’?) a Tdt kapcsolja hozzá. Lehet közvetlenül jelölt (pl. biotinnal), vagy lehet használni specifikus ellenanyagot a kimutatására. Annexinek – Ca2+ dependens foszfolipid kötő molekulacsalád. Fluoreszcens festékkel jelölhető.

49 Kromoszóma Analízis és szeparálás
Kromoszómák is analizálhatóak és izolálhatóak áramlási citométerrel megfelelő kezelés után. Elterjedt módszer két különböző DNS festék használata: a Hoechst 33258, amely AT-gazdag régiókhoz, és a chromomycin A3, amely GC-gazdag régiókhoz kötve a kromoszómák jellegzetes festődését okozza. Alapja: a kromoszómák eltérő AT/GC aránya Kromoszóma szeparálás pl. genomikai vizsgálatokhoz lehet hasznos (kromoszóma specifikus pool-ok létrehozása genom projecthez)

50 Normal human Normal hamster Human X hamster Normal mouse Hoechst 33258
Chromomycin A3 J.W. Gray & L.S. Cram

51 Kinetikai mérések citométerrel
Homogén sejtpopulációban az átáramló sejtek valamely tulajdonságának egymás utáni megmérése, annak időbeli változására enged következtetni Megfelelő indikátor használatával lehetséges az intracelluláris Ca2+ szignál mérése áramlási citométer segítségével Ilyen a sejtbe „tölthető” fluoreszcens Ca2+ indikátor festék a Fluo-3 vagy az Indo-1

52 Az intracelluláris Ca2+ szinttel arányos fluoreszcencia
Ca2+ szignál mérése áramlási citométerrel Az intracelluláris Ca2+ szinttel arányos fluoreszcencia idő pl. Fluo-3 vagy Indo-1 Magyarázat a következő ábrán a sejtek aktiválása alapjel

53 Ca2+ szignál mérése áramlási citométerrel
Influenza vírus hemagglutinin fehérje eredetű peptidre specifikus T sejt hibridóma Ca2+ szignálja a peptidet bemutató antigén prezentáló sejt hatására. Aktiválódott T sejtek A sejtek aktiválásával eltelő idő (az APC és T sejt összecentrifugálása) 1. Alapjel: aktiválatlan sejtek normál Ca2+ szintjének megfelelö fluoreszcencia (Legalul a ”tengelyen” fekete sávként látszik a festetlen APC-k autofluoreszcens sávja is.) 2. Aktiválás: a sejteket tartalmazó csövet kivesszük a citométerböl, majd gyorsan lecentrifugáljuk. Az egymásra centrifugált sejtek képesek receptor-receptor (MHC-TCR) kapcsolatot kialakítani egymással. Ez alatt az idö alatt a citométer nem mér eseményeket. Ez az üres sáv oka. (Látni néhány a készülékben ragadt ”szennyezö” sejtet is közben.) 3. A sejteket gyorsan felszuszpendáljuk, és visszahelyezzük a citométerbe. Az aktiválódott T sejtek magasabb fluoreszcenciát mutatnak. A hirtelen nyomásváltozástól az áramlás legelején a sejtek még turbulensen áramlanak, ezért az a rövid függöleges fekete sáv. Az APC-k sávja alul itt is látható. B sejtek esetén az aktiválás pl. a sejtekhez adott BCR elleni ellenanyaggal történhet, és sokkal rövidebb idöt igényel, ezért esetleg látható lenne a Ca2+ szignál felfutása is. Aktiválatlan T sejtek

54 Imaging cytometry, LSC…..
(Részletesebb morfológiai információk) tükrözheti: sejtek differenciáltsága sejtosztódás vándorló sejtek forrás: brosúra

55

56

57 A limfociták poliklonális aktivációja LPS,
lektinek, PMA/ionomicin jelenlétében B sejt T sejt T sejt Az Ionomycin a külső Ca2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA-val LPS is a polyclonal B-cell activator in mice. LPS works via CD14 and TLR4 receptor. A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. LPS a CD14+TLR4 komplexen keresztül aktiválja a sejteket BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák

58 Poliklonális T sejt aktivátorok
Poliklonális B sejt aktivátorok hatásai Aktivátor T sejt függés Ig szekréció Humán B sejt PWM (pokeweed mitogen) nincs van SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) EBV (transzformáló hatású is) Anti-Ig citokinek jelenlétében Egér B sejt LPS PWM PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) pokeweed - Phytolacca americana (Álkörmös) Poliklonális T sejt aktivátorok Phytohaemagglutinin (PHA) lektin Canavalia ensiformis Concanavalin A (ConA) Phaseolus vulgaris anti-CD3 Monoklonális ellenanyag

59 Pokeweed (PWM) (Phytolacca americana) - Álkörmös Termését borszínezésre használták, aztán rájöttek, hogy mérgező (triterpénszaponin, és mitogén lektin) Mo.-n dísznövényként tartják Chenopodiales (libatopvirágúak) Phytolaccaceae (álkörmösfélék)

60 Phytohaemagglutinin (PHA)  Canavalia ensiformis – Jackbean, Sword bean - Kardbab

61 Concanavalin A (ConA)  Phaseolus vulgaris – (vetemény) bab