A B ÉS T SEJTEK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA 2. rész. Az antigén-specifikus T és B sejtek gyakorisága kicsi. A poliklonális T/B-sejt aktivációt kiváltó anyagok,

Az előadások a következő témára: "A B ÉS T SEJTEK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA 2. rész. Az antigén-specifikus T és B sejtek gyakorisága kicsi. A poliklonális T/B-sejt aktivációt kiváltó anyagok,"— Előadás másolata:

1 A B ÉS T SEJTEK FUNKCIONÁLIS VIZSGÁLATA 2. rész

2 Az antigén-specifikus T és B sejtek gyakorisága kicsi. A poliklonális T/B-sejt aktivációt kiváltó anyagok, és módszerek hasznosak lehetnek a sejtek funkcionális vizsgálatában.

3 Poliklonális T/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata Az antigénnel való aktiválás technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi

4 A T és B limfociták funkcionális aktivitásának mérése nem antigén-specifikus A TCR vagy a BCR nem antigén-specifikus aktivációjával - lectinek-indukálta aktiváció - α-IgM, α-CD3 vagy α-TCR ellenanyaggal, allogén T-sejt aktiváció (korai aktiváció: intracelluláris események vizsgálata) aktivációs markerek (IL2R, integrinek) ellenanyag és/vagy citokin termelés (ELISA, bioassay) proliferatív válasz 3 H-timidin beépülése CFSE fluoreszcencia feleződés sejtciklus vizsgálata 3. Az aktivált T, B sejtszám meghatározása az Ag-el való találkozás után ELISPOT intracelluláris citokin festés tetramer festés 1. A T-és B sejtek poliklonális aktivációja: 2. Az aktivációt követő T-és B-sejt válasz jellemzése

5 Poliklonális B sejt aktivátorok hatásai AktivátorT-sejt függésIg szekréció Humán B sejt PWM (pokeweed mitogen) nincsvan SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) nincsvan EBV (transzformáló hatású is) vanvan Anti-Igvan citokinek jelenlétében Egér B sejt LPSnincsvan PWMvanvan PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) nincsvan Anti-Ignincs citokinek jelenlétében Poliklonális T sejt aktivátorok Phytohaemagglutinin (PHA) lektin Canavalia ensiformis Concanavalin A (ConA) lektin Phaseolus vulgaris anti-CD3 Monoklonális ellenanyag

6 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) Western blot - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció - IC citometria - ELISA, ELISPOT - Bioassay Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációjának vizsgálata Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul

7 Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges) Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik Standard Protein minta SDS-PAGE Membrán Western blot Fehérje detektálás specifikus ellenanyag- epitóp kölcsönhatás alapján Western Blot

8 egy adott fehérje jelenléteSegítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában elektroforézis SDS-PAGE)/, membránra transzferáljákAz egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)/, membránra transzferálják Primer ellenanyagot (monoklonálisPrimer ellenanyagot (monoklonális vagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához anti-foszfotirozin at (pl., anti-foszfotirozin at) szekunder ellenanyagEnzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését

9 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció RT-PCR - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció - IC citometria - ELISA, ELISPOT - Bioassay Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációjának vizsgálata Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul

10 módszer: RT-PCR, QRT-PCR A génaktiváció vizsgálata Az aktiválódó génekről átíródó mRNS kimutatása. pl. citokin gének aktivációja sejtek  RNS izolálás RNS  (Reverz transzkriptáz)  cDNS cDNS  (PCR)  hossz és mennyiség meghatározás RT-PCR: agaróz gél (denzitometria) QRT-PCR: fluoreszcens módszer (FRET)

11 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció RT-PCR - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció IC citometria - IC citometria - ELISA, ELISPOT - Bioassay Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációjának vizsgálata Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul

12 A termelődött citokinek intracelluláris kimutatása immunfluorimetriával jelzéssel ellátott citokin specifikus ellenanyag - a sejtmembránt detergenssel átjárhatóvá kell tenni - de előtte a sejteket fixálni kell, hogy ne essenek szét a detergenstől (pl. aldehides fixáció) citokinek - előzőleg a sejtek valamilyen, a sejttípusra jellemző antigént felismerő ellenanyaggal is megjelölhetők („sejttípus marker” pl. CD4)

13 Eredmény: Meghatározható, hogy milyen sejttípusok termelték a citokineket! Érzékenysége elérheti a Western blotot (hűtött CCD mikroszkóp), de egyetlen sejt is elegendő lehet a vizsgálathoz.

14 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció - IC citometria ELISPOT - ELISA, ELISPOT - Bioassay Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációjának vizsgálata Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul

15 ELISPOT Enzyme Linked Immuno-Spot Elve hasonlít az ELISA-hoz. Eredetileg az ellenanyagot szekretáló B-sejtszám meghatározása Alkalmas egyéb effektor molekulák, pl. citokinek, kemokinek, granzim temelő sejtek számának meghatározására is. Alkalmas poliklonális aktivátorok vagy antigén indukálta aktivációt követően az aktivált effektor sejtek számának meghatározására. Érzékenység: 1/300 000 sejt. Sejtkultúra felhasználása, aszeptikus körülmények

16 ELISPOT - a capture ellenanyagok kitapasztása - blokkolás - a sejtek hozzáadása - biotinnal konjugált másodlagos ellenanyag hozzáadása - avidin-enzim konjugátum - oldhatatlan kromogén szubsztrát hozzáadása (aktiválás, inkubáció) - mosás citokin termlő sejt helyét mutató folt ELISPOT lemez egy lukának felülnézete a képződött foltokkal

17 leolvasása mikroszkóppal (lassú, manuális munka) vagy “ELISPOT plate reader” segítségével (gyors, standardizálható spot szám és méret meghatározás)

18 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció - IC citometria - ELISA, ELISPOT - Bioassay Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációjának vizsgálata Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul

19 Citokinekre érzékeny (citokin szenzitív), vagy csak citokinek jelenlétében túlélni/osztódni képes (citokin dependens) sejtvonalak segítségével a jelenlevő citokinek nagy érzékenységgel kimutathatók.Bioassay pl. Wehi-164 sejtek (fibrosarcoma) pl. CTLL2 sejtek van IL-2nincs IL-2 van TNFnincs TNF

20 Bizonytalanná teheti a kapott eredményt, hogy a sejtek nem biztos, hogy csak az adott citokinre reagálnak. Pl. a CTLL2 sejtvonalra az IL-4 hasonló hatást fejt ki, mint az IL-2. A sejtek túlélését kolorimetriás eljárással (MTT assay) vagy az osztódásuk kimutatásával (lásd később) mérhetjük meg. citokinkoncentráció IL-2 TNF CTLL2 Wehi 164 MTT assay: (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromid, sárga tetrazol) MDH-enzim formazán (lila)

21

22 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció - IC citometria - ELISA, ELISPOT - - Bioassay Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációjának vizsgálata Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul

23 Sejt ciklus meghatározás „Sejt jelző” festék – a sejtbe diffundál. Az apoláros CFSE kovalensen kötődik az IC sejtfehérjékhez. Sejtosztódás során a mennyisége „hígul” a két utódsejtben. sejtosztódások : 7 6 5 4 3 2 1 0 CFSE=carboxyfluorescein succinimidyl ester

24 Receptorok ligand általi aktivációja („keresztkötés”) (pillanatszerű) foszforilációs lépések (másodpercek-percek) - Western blot - Bead array ic Ca 2+ szint emelkedés - FACS, mikroszkópia Génaktiváció - RT-PCR Citokin szintézis Citokin szekréció - IC citometria - ELISA, ELISPOT - - Bioassay Ez történik az antigénreceptorokkal (TCR, BCR), és sok más receptorral is (citokinreceptorok) Sejtciklusba lépés/apoptózis - DNS tartalom - IN antigének Sejtosztódás - 3 H-timidin, CFSE, MTT A limfociták aktivációjának vizsgálata Vizsgálatuk gyakran a specifikus antigén- ellenanyag kapcsolódáson alapul

25 Citokin array A Western-blot blotolási lépését követő részére hasonlít ( - ) IFN  ( + ) IL-2IL-4… … MIP3β… különféle kikötött specifikus ellenanyagok Vizsgálandó citokin tartalmú oldat „Lumineszcens elleanyag” keverék Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas Hátrány – a blot memrán nagy felülete miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

26 CD40L és CD40L+SLAM kombinációval aktivált moDC citokintermelése Réthi és mtsi. 2006 A fluoreszcens gyöngyökkel elvégezhető variációjához klikkelj ide

27 CitokinBetegségMellékhatás Interferon-  IFN-  I. típusú Hajas sejtes leukémia, krónikus mieloid leukémia (CML), melanoma, Kaposi- sarcoma, Hepatítisz-B, -C Renális cc., T-sejt leukémiák Láz, influenzás tünetek, fogyás, fáradékonyság, Interferon-  IFN-  I.Típusú Szklerózis multiplex (relapszus-remisszió) Láz, influenzás tünetek, fogyás, fáradékonyság Interferon-  IFN-  II. Típusú Krónikus granulóma betegség (CGD)Láz, influenzás tünetek, fogyás, fáradékonyság IL-2Metasztatizáló renális cc.Láz, influenzás tünetek, fogyás, fáradékonyság rGM-CSF, rG-CSF Csontvelő átültetés, őssejt mobilizáció, Szupportív terápia onkohematológiában Citokinek alkalmazása különféle betegségekben