2D gélelektroforézis a proteomikában

Az előadások a következő témára: "2D gélelektroforézis a proteomikában"— Előadás másolata:

1 2D gélelektroforézis a proteomikában

2 A proteom a genomról expresszálódott fehérjekészlet.
Bevezetés Proteomika Proteome: „the PROTEin complement expressed by a genOME” (Mark Wilkins, 1994) A proteom a genomról expresszálódott fehérjekészlet. Térben és időben dinamikusan változik A proteomika a proteomok jellemzésével foglalkozó tudományág.

3 Új információk nyerhetőek a különböző állapotú sejtek, organizmusok fehérjekészletének összehasonlításával. - stressztoleranciáért felelős fehérjék - virulenciáért felelős fehérjék - rezisztenciáért felelős fehérjék - betegségek kialakulásáért felelős fehérjék - transzkripciós faktorok célgénjeinek terméke Vizsgálata: Két-dimenziós gélelektroforézis + tömegspektrometria Kvantitatív tömegspektrometria

4 Miért 2D gél? A proteomok nagyon komplexek (ember:~ fehérje), ezért szükség van egy elválasztási technikára ami: reprodukálható nagy felbontású (1D-kb. 100 fehérjesáv, 2D kb spot) megengedi a minták kvantitatív összehasonlítását megengedi a poszt-transzlációs módosítások detektálását

5 Mi az a 2D gél? Az első és második dimenziós elválasztás különböző „molekuláris tulajdonság” alapján történik: Első dimenzió = izoelektromos pont - izoelektromos fókuszálás Második dimenzió = molekula tömeg - SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid-gélelektroforézis)

6 Izoelektromos fókuszálás Festés és vizualizáció
SDS PAGE Mintaelőkészítés Fehérjék azonosítása MS Festés és vizualizáció Spotok kivágása Gélképek analízise

7 Mintapuffer denaturáló szerek nem-ionos vagy zwitter-ionos detergensek
A legtöbb mintapuffer a következő összetevőket tartalmazza: denaturáló szerek nem-ionos vagy zwitter-ionos detergensek redukáló szerek carrier amfolitok brómfenolkék

8 Izoelektromos fókuszálás
Mintaelőkészítés

9 Izoelektromos fókuszálás
pH 3 pH 10 A fehérjék amfoterek, emiatt a töltésük változik a környezetük pH-jától függően Izoelektromos pont: ezen a pH érteken a fehérje töltése nulla

10 Strip-ek Egy kis történelem…… Patrick O’Farrell:
1975, J Biol Chem 250, gél rúd „mobil” pH gradiens rossz ismételhetőség nehéz kezelhetőség Az első

11 Még mindig nehezen kezelhető
1982, J.B.B.M. 6: Rögzített pH gradiens Még mindig nehezen kezelhető 1988, Electrophoresis, vol 9, p 531 A gél fóliára rögzítése Könnyen kezelhető Reprodukálható Pier Giorgio Righetti

12 Strip-ek A pH gradienst tartalmazó nagyon lágy (4%) gél egy vékony fóliához van polimerizálva és rászárítva Sokféle pH gradiens (Pl.: 3-10, 4-7, 5-8, 9-11) Számos méret (7, 11, 17, 18, 24 cm) Néhány cégnél lehet a szokásostól eltérő pH tartományú, hosszúságú strip-et rendelni

13 Izoelektromos fókuszálás
Tálcákban történik A stripek olajjal vannak lefedve Limitált áramerősség mellett (50 µA) Magas feszültség mellett ( V, 17 cm-es stripnél) 20 OC-on Általában optimalizálni kell a futtatási időt

14 Izoelektromos fókuszálás
SDS PAGE Mintaelőkészítés

15 SDS-PAGE A fehérjéket „beburkoljuk” SDS-el (anionos detergens) ezáltal egységesen negatív töltést kapnak A fehérjék az anód felé törekszenek, ha elektromos mezőbe helyezzük őket A fehérjék mozgása a gélben csak a relatív molekula-tömegüktől és az alkalmazott gél pórusátmérőjétől függ

16 Strip ekvilibrálás Az elsődleges cél, hogy a fehérjéket SDS-el beburkoljuk Egyéb célok: a strip teljes hosszában egységessé tenni a pH-t (1,5 M Tris puffer, pH 8.8) redukálni (újra) és alkilálni a cisztein oldalláncokat, ezért két lépcsőben történik az ekvilibrálás: redukálás DTT-vel, a visszaalakult kén hidak megszüntetése a cél

17 alkilálás jódecetsavval, a redukált cisztein oldalláncok végleges módosítása a cél, de a maradék DTT/DTE is elreagál a jódecetsavval, ezért a redukáló szerekhez képest 3-10-szeres mennyiségben alkalmazzuk. Az elektro-ozmózis elkerülése miatt a stripeket 20-30% glicerinnel is átitatjuk

18 SDS-PAGE A leggyakrabban használt technikák Laemmli 1970-ben publikált technikájára épülnek két fontos különbséggel: A ‘stacking’ gélt kiváltja a strip, mivel annyira lágy gél, hogy tökéletesen képes azt pótolni A stripet a szeparáló gél tetejére kell ragasztani felolvasztott agaróz segítségével

19

20 Izoelektromos fókuszálás Festés és vizualizáció
SDS PAGE Mintaelőkészítés Festés és vizualizáció Gélképek analízise

21 Gél festése Többféle festési eljárás létezik
A három leggyakrabban alkalmazott Ezüstfestés: nagyon érzékeny, de nem végpontos, ezért nem alkalmas mennyiségi összehasonlításra Coomassie festés: kevésbé érzékeny, mennyiségi összehasonlításra alkalmas Fluoreszcens festések (pl.: SyproRuby): nagyon érzékenyek, kvantitatív festés, de detektálásuk drága berendezést igényel

22 RuBPS Sypro Ruby BioSafe Coomassie Silver

23 Gél analízis Számítógépes programok segítségével
PDQuest, Melanie, Dimension, Phoretix 2D Automatikus spot detektálás és matching A spot kiterjedését és intenzitását veszik figyelembe a mennyiségi analízisnél

24

25 Hasznos linkek proteomicsnetwork.de/