Transzláció prokariótákban

Az előadások a következő témára: "Transzláció prokariótákban"— Előadás másolata:

1 Transzláció prokariótákban

2 A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek
30S* + mRNA PK k1 k-1 k2 k-2 IK TK k3 ( 30S + IF1, IF2, IF3, fMet-tRNSMet) ( preiniciációs komplex) ( iniciációs komplex) ( transzlációs komplex) K1 nagy, ha az SD és a rRNS közti kölcsönhatás erős. k2 a SD és a transzlációs start kodon közti távolság, és a régió másodlagos szerkezetének függvénye.

3 A transzláció hatékonyságát meghatározó elemek technikai megközelítés

4 Shine - Dalgarno szekvencia
GGAGG a tökéletes komplementer a 16S rRNS 3'végéhez, pl. GAAG GGAG mutáció (maltóz operon) 10 x növekedés a termék mennyiségében a SD szekvencia hosszának növelése nem feltétlenül növeli a transzlációt Hasonlóan a promóterekhez, túl erős kötődés a SD szekvencia és a 16S rRNS 3’ vége között a transzlációt gátolhatja. Transzlációs start kodon kodon gyakoriság AUG 91 % GUG 8 % UUG 1 %

5 Az AUG előtti szekvenciák
20x-os különbség UAU, CUU >> UUC, UCA, AGG ("-1 triplet) G-k kerülendők Az AUG utáni szekvenciák 30x -oskülönbségek lehetnek AAA(Lys) > AAG(Lys) > UUU(Phe), AUC/A(Val), GUA(Ala)... A természetes gének között is az AAA(Lys) és GCU(Ala) transzlációs szabályozás a 2. kodonnal +10 régió AT gazdag

6 Távolság a start kodon és a SD között
- meglehetősen érzékeny, általban bázispár megengedett. - Génfüggő, egy gén esetén általában csak kicsit változhat. A köztes szekvencia összetétele “A” jó, ha van (2x-es stimulus), “C” mindegy “U” a "-4"-es pozícióban hatékony “G” gátol (3x-os gátlás) Upstream nemtranszlálódó szekvencia Nem nagyon vizsgált, de kell, mert eltávolítása megszünteti a transzlációt (ld lac). Minimum 10 bp kell. Esetleg valamilyen faktorok kötődnek hozzá.

7 Kodon felhasználási preferencia
Bár a kodonok gyakorlatilag univerzálisak, a különböző sejtféleségek különböző gyakorisággal használják az azonos aminosavakat kódoló tripleteket. Ha a termeltetendő fehérje génjének kodon használata nagyon eltér a gazdasejtétől, akkor meg kell szintetizáltatni a gént a gazda sejt preferenciájának megfelelően. Alternatív megoldás: a gazdasejt kodon preferenciájának megváltoztatása, ritka kodonokhoz tartozó tRNS gének bevitelével

8 Kodon felhasználási preferencia – táblázat
Sphingomonas paucimobilis AmAcid Codon Number / Fraction Gly GGG Gly GGA Gly GGT Gly GGC Glu GAG Glu GAA Asp GAT Asp GAC Val GTG Val GTA Val GTT Val GTC Ala GCG Ala GCA Ala GCT Ala GCC Arg AGG Arg AGA Ser AGT Ser AGC Lys AAG Lys AAA Asn AAT Asn AAC Met ATG Ile ATA Ile ATT Ile ATC Thr ACG Thr ACA Thr ACT Thr A CC Trp TGG End TGA Cys TGT Cys TGC End TAG 0.10 End TAA Tyr TAT Tyr TAC Leu TTG Leu TTA Phe TTT Phe TTC Ser TCG [gbbct]: 50 CDS's (13879 codons) egy adott gén esetén a kodon preferencia alapján a gén E. coli-ban, vagy élesztőben való expresszálhatósága in silico becsülhető.

9 STOP kodon STOP kodon UAA UGA UAG kötődő faktor RF1, RF2 RF1 RF2
Az esetek 80 %-ában: UAAU

10 KÉT CISZTRONOS EXPRESSZIÓS RENDSZER
1 Cisztronos rendszer SD 5’ ATG struktúrgén STOP 3’ mRNS 2 Cisztronos rendszer termeltetendő fehérje 1. SD 1. STOP 5’ 3’ ATG 1. cisztron ATG 2. cisztron mRNS 2. SD 2. STOP Az 1. cisztron tetszőlegesen tervezhetú, de: - ne legyen túl hosszú, hogy ne terhelje feleslegesen a sejtet (felesleges műtermék) néhány aminosav - AT gazdag legyen a másodlagos struktúrák elkerülése végett.

11

12 képest meghatározó a transzláció hatékonysága szempontjából.
1 Cisztronos rendszer SD 5’ ATG struktúrgén STOP 3’ mRNS 2 Cisztronos rendszer termeltetendő fehérje 1. SD 1. STOP 5’ 3’ ATG 1. cisztron ATG 2. cisztron mRNS 2. SD 2. STOP Az 1. cisztron STOP kodon pozíciója a 2. cisztron Shine-Dalgarno szekvenciájához képest meghatározó a transzláció hatékonysága szempontjából. PÉLDA bGH (marha növekedési hormon) Egy cisztronos rendszerben < 0.4 % fehérje Két cisztronos rendszerben 1. cisztron ...GGAGGAATAACATATG...2. cisztron. elrendeződésben 24 % fehérje termeltethető

13 Kifordított – antiriboszómális kötőhelyen alapuló - rendszer

14 PROTEOLÍZIS E. coli-ban
Abnormális fehérjék proteolitikus lebontási mechanizmusa E. coli-ban Abnormális fehérjék, sejten belüli aggregátumok ATP függő endoproteázok polipeptidek < 1500 Da endoproteázok peptidek aminosavak oldékony mono-, di- és tripeptidázok

15 La (Lon) a fő ATP függő proteáz
87 kDa egységekből felépülő homotetramer, ATP és Mg2+ függő, az ATP-áz aktivitás nem a polipeptid kötés felbontásához, hanem a degradálandó fehérjén való végiglovagláshoz kell, in vitro 2 ATP/ peptidkötés, in vivo ez változhat, és ennél nagyobb. hasonló fehérjék előfordulnak magasabbrendűekben is, pl. egy máj mitondriális proteáz immunológiailag keresztreaktív abnormális fehérjék, és rövid élettartamú (pl. szabályozó fehérjék bontása) szerin proteáz, hidrofób jellegű szekvenciáknál hasít alapállapotban inaktív, a szubsztrát fehérje hozzákapcsolódása aktiválja, a lon gén terméke, és a sokk fehérjékhez kapcsolódó szabályozás alatt áll: 32 faktor, ami a htpR (rpoH) gén terméke

16 Proteolitikus ciklus inaktív proteáz (4 ADP) protein szubsztrát 4 ADP
4 PO43- 4 Mg 2+ 4 ATP - Mg2+ alloszterikus aktiválás aktív proteáz (4 ATP)

17 Genetikai vonatkozások
léteznek inszerciós, deléciós lon mutánsok A lon- mutáció másodlagos hatásai Poliszaharid burok képzés (főleg alacsonyabb hőmérsékleten, mint 34oC) Megoldás: 37oC-on növeszteni galE struktúrgének inaktiválása cps (capsule) struktúrgének inaktiválása rcsB, rcsA szabályozó régió mutánsok A lon mutánsok UV érzékenyek DNS sérülés  filamentáció Gazdag médiumon akár letális is lehet ok: SOS indukálható sejtosztódás inhibitor SulA. Megoldás: - ne használjunk yeast extraktot, hanem tryptont - sulA mutánsok

18 ATP hidrolízis mellett
Ti (Clp) a másik ATP függő proteáz 81 (ClpA) és 21 kDa (ClpP) alegységekből álló heterodimer, ez multimerizálódik, a natív enzim kb 700 kDa móltömegű ATP és Mg2+ faktorok szükségesek hidrofób részeknél hasít, de a specificitás eltér a La-tól az alegységek külön multimerizálódnak HtpR szabályozás alatt áll Tulajdonság Ti (Clp) proteáz ClpP ClpA aktivitás fehérje degradáció ATP hidrolízis mellett peptidáz ATP független ATP-áz fehérje aktivált Kofaktor Mg2+ - Inhibítor MalNEt, iPr2P-F iPr2P-F MalNEt Stabilizálás ATP, glicerin hőstabil natív méret 700 kDa 260 kDa 160 kDa alegységek 6 ClpA + 12 ClpP 21 kDa 81 kDa

19 Genetikai vonatkozások
Rendelkezésre állnak clp mutánsok a mutáns egyedül nem, de a lon- nal együtt hatékony Egyéb proteázok OmpT külső membránhoz kapcsolódó proteáz DegP periplazmatikus proteáz T4 fág fertőzés stabilizálja a fehérjéket pin gén terméke: La inhibitor

20 Példák proteázaikban mutáns E. coli törzsekre
genotípus Kiindulási törzs Megjegyzés lon mutánsok SG1117 Dgal Dlac lon-146::DTn10 leu sup+ rec+ HB101 Tetraciklin rezisztens, jól transzformálható SG12041 Dgal, Dlon-510 sulA recA C600 nincs filamentáció Rec- lon htpR mutánsok SG21163 Dlon-510 supFts htpRam165 MC4100 hőmérséklet érzékeny lon clp mutánsok SG12044 Dgal Dlon-510 sulA clpA319::Dkan kanamycin rezisztens lon clp htpR mutánsok SG21173 DclpA319::Dkan Dlac kanamycin rezisztens,

21 FÚZIÓS FEHÉRJÉK ELŐNYEI
A fúziót gén szinten hozzuk létre úgy, hogy a fúziós partnerek génjeit a megfelelő leolvasási keretben úgy klónozzuk össze, hogy az 5’ vég felőli génhez tartozó transzlációs stop kodon ne szerepeljen. Így egy polipeptidláncot kapunk, amelyben a kiinduási fehérjék egymást követő régiókként helyezkednek el. ELŐNYEI 1. Kis peptidek esetén a fúzió proteolitikus stabilitást jelenthet 2. Óriási előny a tisztítás során, affinitás oszlopok 3. szignálpeptiddel való fúzió, szekretált fehérje (limitált) 4. Az in vitro hasítás sokszor pontosabb, intaktabb N-terminális szekvenciát eredményez

22 Fúziós fehérjék oldhatósága
Oldhatatlan "iclusion bodies" trpEII, vagy cII, nincs proteolízis, differenciális centrifugálással az "inclusion body" könnyen tisztítható, probléma: nem aktív fehérje pl sometostatin, inzulin A, B, ellenanyag termelés Oldható forma biológiailag aktív fehérje, affinitás oszlopon való tisztítás problémák a stabilitással, kevésbé jósolható

23 Egyéb hasznosítási lehetőségek
1. a szignál peptidekkel való fúzió előnyei (ld. később) a periplazmában, illetve az extracelluláris térben oxidatívabb környezet, diszulfid hidak kialakulása, pl. EGF, IGF A periplazmában az összfehérje 4%-a található, értelemszerűen kevesebb proteáz,könnyebb tisztítás 2. A fúzionált fehérje linkerként szolgál, és így a kívánt fehérje immobilizálható 3. funkcionális, struktúrális vizsgálatok, pl. immunológiai felhasználás alkalmasan választott fúziós partner esetén nincs szükség hasításra. 4. megfelelő hasítás után az intakt fehérje tetszőleges biokémiai, biofizikai vizsgálata

24 A fúziós fehérjék tisztításának elve
I. 1. affinitás kromatográfia II. hasítás III. 2. affinitás kromatográfia tiszta fehérje fúziós partner célfehérje

25 A fúziós fehérjék típusai I.
I. Szekréció Megjegyzés pl. humán növekedési hormon alkalikus foszfatáz szignál szekvenciával S X T P II. Polimerizáció fehérje-élettartam növekedés, pl. proinzulin 1-2 percről 60 perc, IGF 200x-os növekedés P T X X III. C-terminális fúzió a fúziós partner intakt szabályozó régiója használható, pontosabb proteolitikus hasítás A X T P IV. N-terminális fúzió amino terminális szekvenciák meghatározása, a proteolititkus hasítás csonkot hagyhat a “B” N-terminálisán X B T P

26 A fúziós fehérjék típusai II.
V. A szekréció és a C-terminális fúzió kombinációja A X S T P a termék folyamatosan kinyerhető affinitáskromatográfiával VI. Kettős fúzió A X B T P nagy tisztaságú, nagy stabilitású termék, hátrány: két tisztítás, hasítás szükséges P T A B X P T X A B VII. Szekréció-inszerció X I S T P membrán fehérjék termeltetése a membránban

27 Fúziós partnerfehérjék
Fehérje Származási hely molekulasúly (kDa) szekréció ligand b-galaktozidáz Escherichia coli 116 - TPEG, APTG Protein A Staphylococcus aureus 31 + IgG Z szintetikus 7 CAT 24 klóramfenikol sztreptavidin Streptomyces 13 biotin PhoS 36 hidroxilapatit Protein G Streptococci 28 albumin MBP 40 keményítô GST 26 glutation poliarginin 1-3 ioncsere poliglutamát 1-2 polihisztidin 1-7 Ni2+, Zn2+, Cu2+ CAT: klóramfenikol-acetiltranszferáz; Z: A Protein A fehérje IgG kötô doménje; PhoS: foszfát kötô fehérje; MBP: maltóz-kötô fehérje; GST: glutation S-transzferáz; TPEG: p-aminofenil--d-tiogalaktozidáz; APTG: p-aminofenil--d-tiogalaktozid.

28 FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI I.
KÉMIAI hasító ágens hasítási hely brómcián - Met  hangyasav - Asp  Pro - hidroxilamin - Asn  Gly - ENZIMATIKUS aminopeptidázok 1 - 3 aminosavat hasítanak az N-terminálisról karboxipeptidázok 1 - 2 aminosavat hasítanak a C-terminálisról

29 FÚZIÓS FEHÉRJÉK HASÍTÁSI MÓDOZATAI II.
ENZIMATIKUS Endopeptidázok ENZIM HASÍTÁSI HELY kollagenáz - Pro - Val  Gly - Pro - enterokináz - Asp - Asp - Asp - Lys  Xa faktor - Ile - Glu - Gly - Arg  trombin - Gly - Pro - Arg  tripszin - Arg, Lys  klosztripain - Arg  Ala64-szubtilizin - Gly - Ala - His - Arg 

30 A fehérje szekréció Előnyei Nómenklatúra:
szekréció: az extracelluláris térbe export: az sejtmembránokba vagy a periplazmatikus térbe Előnyei A tisztítás sokkal egyszerűbb, esetleg folyamatos üzemű lehet Az periplazma illetve az extracelluláris tér sokkal oxidatívabb, korrektebb protein folding A fehérje degradáció sokkal csekélyebb mértékű, proteolitikusan stabilabb termékek

31 Baktériumok membránszerkezete

32 SZEKRÉCIÓ E. coli-ban nem hatékony vagy nem teljes transzport a membránon keresztül alacsony transzport-kapacitás, stresszválasz, idő előtti fehérjedegradáció ha a transzporthoz a fehérje poszttranszlációs módosítása szükséges, akkor ennek hiánya kis molekulákra, mint növekedési faktorok vannak jó eredmények nagy molekulák esetén problémák lehetnek, pl az ER hiánya (módosítások színhelye) vannak fehérjék, amelyek nem szekretálhatóak, esetleg letális, pl -galaktozidáz fúziós fehérjék exportja

33 Fő protein transzport mechanizmusok bacteriumokban
Kotranszlációs transzport SRP, signal recognition particle, és receptora E. coli homológ: Ffh forty five homolog, FtsY Poszttranszlációs transzport Sec útvonal: egyszerű kofaktor mentes polipeptidekre Tat útvonal: több alegységes enzimekre, amelyek kofaktorokat is tartalmaz(hat)nak transzport: a fehérje összeszerelődése után

34 Sec útvonal E. coli-ban - szignál szekvencia,
- szignál szekvencia, - szignál peptidázok, szignál peptidázI (lep), Ala-X-Ala felismerőhely - szignál peptidázII (lsp), szignál szekvenciák eltávolítása lipoproteinekrôl - sec A, B, D, E, Y gének mutációja a prekurzorok felhalmozódásához vezet, Némi átfedés van közöttük. - Régebben prl nómenklatúra is volt SecA, 102 kDa, citoplazmatikus, és belső membránkötött, ATP-áz aktivitás, kölcsönhatás a szállítandó fehérjével SecB szekréció kompetens konformációért felelős SecYEFG a csatorna kialakításáért felelős SecD a periplazmatikus térbe való “leválásért”

35 SZIGNÁL SZEKVENCIÁK GRAM- BAKTÉRIUMOKBAN I.
Standard szignál peptid COOH “N” “H” “C” 1 K vagy R hidrofób  hélix, sok A és L, nem lehet P, K, R, D, E, H, R fordulat P G hasítóhely A S -1 +1 X semleges vagy negatív fM V -3 Lipoprotein szignál peptid “C” COOH “N” “H” 1 K vagy R hidrofób  hélix, sok A és L, nem lehet P, K, R, D, E, H, R hasítóhely A G -1 +1 D lipoprotein kiválasztó szignál semleges vagy negatív fM L

36 SZIGNÁL SZEKVENCIÁK II.
Gram-pozítív baktériumok a szignál peptid szignifikánsan hosszabb kiterjedtebb “H” régió Eukarióták a “H” régióban a Leu dominál nem olyan szigorú a (-1, -3) szabály a hasítóhely után nincs kitüntetett aminosav az eukarióta szekretált fehérjéket az E. coli export mechanizmusa felismer(het)i, illetve fordítva

37 A Sec függő fehérje transzlokáció modellje
E. coli-ban ATP ADP+Pi SPáz Y E G A B D H+ periplazma citoplazma INICIÁCIÓ TRANSZLOKÁCIÓ KISZABADULÁS N+ C+ C N Átjutás a C-terminális véggel, ez az áltatános Átjutás az N-terminális véggel, inszerció

38 A Sec útvonal - másképpen

39 A Sec útvonal - másképpen

40 A prokarióta és eukarióta transzportmechanizmusok összehasonlítása

41 Az SRP (Ffh-FtsY) útvonal
membrán fehérjékre jellemző A Sec és az SRP közötti választás: “trigger” faktor

42 + + Signal sequences for targeting Sec szignál peptid
erősen hidrofób + n-region h-region c-region SRP: erősen hidrofób szignál, nem hasad le Twin-arginine szignál peptid moderáltan hidrofób + N S/T-R-R-x-F-L-K n-régió h-régió c-régió

43 A periplazmitikus hidrogenázok bioszintézise citoplazmatikus összeszerelődési modell
Holoenzim Periplazma csatorna Citoplazma szignál peptid prekurzor kofaktor(ok)

44 The twin-arginine translocase (Tat) proteins
citoplazma membrán periplazma N C TatA TatE TatB TatC

45 aktív formát felvett enzim
A TAT modell citoplazma TatC TatB TatA membrán aktív formát felvett enzim