Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika

Az előadások a következő témára: "Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika"— Előadás másolata:

1 Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika

2 Elválasztástechnikák
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika Elválasztástechnikák Oszlopkromatográfia 1. Gélszűrés és gélpermeációs kromatográfia 2. Ioncserés kromatográfia 3. Affinitás kromatográfia 4. Adszorpciós kromatográfia Elektroforézis 1. natív 2. SDS 3. izoelektromos fókuszálás 4. 2D elektroforézis

3 1. Gélszűrés és gélpermeációs kromatográfia
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia 1. Gélszűrés és gélpermeációs kromatográfia Az elválasztás alapja: molekulaméret különbség Oszloptöltet: porózus anyag (agaróz vagy keresztkötött poliakrilamid) Eluálás: kiszorítás (sóoldat, víz, híg sav)

4 1. Gélszűrés és gélpermeációs kromatográfia
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia 1. Gélszűrés és gélpermeációs kromatográfia sómentesítés, puffercsere frakcionálás, molekulatömeg meghatározás

5 2. Ioncserés kromatográfia
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia 2. Ioncserés kromatográfia Az elválasztás alapja: töltéskülönbség Az oszloptöltet 3 részből áll: -oldhatatlan hordozó (mátrix) -a hordozóhoz kovalens kötéssel kapcsolódó, töltéssel, rendelkező funkcionális csoport -ellenionok Eluálás: az ionkötés megbontásával (sók, pH)

6 2. Ioncserés kromatográfia
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia 2. Ioncserés kromatográfia tisztítás frakcionálás,

7 3. Affinitás kromatográfia
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia 3. Affinitás kromatográfia Oszloptöltet: a ligandum kémiai úton inert porózus matrixhoz kötve Eluálás: a kötés megbontásával (sóoldat, pH, vagy a ligandot tartalmazó oldat) Az elválasztás alapja: Biospecifikus affinitás különbség (antigén/ antitest; enzim/ inhibitor; receptor/ hormon)

8 3. Affinitás kromatográfia
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia 3. Affinitás kromatográfia specifikus ligandok: híg minták tisztítása osztályspecifikus ligandok: tisztítás és frakcionálás

9 4. Adszorpciós kromatográfia
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia 4. Adszorpciós kromatográfia Az elválasztás alapja: felület-affinitás különbség (igen nagy felület a tömeghez képest) normál fázisú rendszer: poláros kölcsönhatás fordított fázisú rendszer: hidrofób kölcsönhatás

10 4. Adszorpciós kromatográfia
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia 4. Adszorpciós kromatográfia Oszloptöltet: -hidroxiapatit (kristályos kalciumfoszfát) -normál fázisú rendszer: szilikagél, aluminiumoxid -fordított fázisú rendszer: derivatizált szilikagél (C4, C8, C18) Eluálás: folyamatos megoszlás az álló és mozgó fázis között -hidroxiapatit: mozgó fázis: foszfát puffer -normál fázisú rendszer: mozgó fázis: apoláros oldószer pl. hexán -fordított fázisú rendszer: mozgó fázis: vizes oldat

11 4. Adszorpciós kromatográfia
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia 4. Adszorpciós kromatográfia tisztítás frakcionálás

12 Fordított fázisú HPLC (RP-HPLC)
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia Fordított fázisú HPLC (RP-HPLC)

13 Fordított fázisú HPLC (RP-HPLC)
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-oszlopkromatográfia Fordított fázisú HPLC (RP-HPLC)

14 Elektroforézis rendszerek
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-elektroforézis Elektroforézis rendszerek Mátrix agaróz poliakrilamid (PAGE) üvegfelület (kapilláris elektroforézis) Futtatórendszer lap elektroforézis horizontális vertikális kapilláris elektroforézis (CE)

15 Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-elektroforézis

16 Fehérjék elelktroforetikus elválasztása
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-elektroforézis Fehérjék elelktroforetikus elválasztása A fehérje tulajdonságai alapján natív: töltés, méret, alak homogén gradiens SDS: méret izoelekromos fókuszálás: izoelektromos pont kétdimenziós elektroforézis: két elektroforézis technika kombinálása (izoelektromos fókuszálás + SDS vagy natív elektroforézis)

17 Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-elektroforézis
2. SDS elektroforézis

18 3. izoelekromos fókuszálás
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-elektroforézis 3. izoelekromos fókuszálás

19 4. kétdimenziós elektroforézis
Mikronalalitikai kurzus elválasztástechnika-elektroforézis 4. kétdimenziós elektroforézis