Szabad aminosavak termelésének kimutatása a talajmikroorganizmusok tenyészetében.

Az előadások a következő témára: "Szabad aminosavak termelésének kimutatása a talajmikroorganizmusok tenyészetében."— Előadás másolata:

1 Szabad aminosavak termelésének kimutatása a talajmikroorganizmusok tenyészetében

2 A talajmikrobiológiai vizsgálatok során a talajban található mikroorganizmusok aktivitását vizsgálják, majd az eredmények alapján következtetéseket vonnak le a talaj állapotára vonatozóan. A mikroorganizmusok aktivitásának jellemzésére sokféle módszert alkalmaznak, köztük az aminosavak kimutatását talajmintákból.

3 A mikroorganizmust talajmintából tenyésztik ki. A tenyésztéshez használt táptalaj összetételét Balicka N. javasolta, innen kapta a módszer a nevét. Az agarlemezeken történő elszaporítást követően többlépéses módszerrel leválasztjuk a vizsgálni kívánt mikrobát. Ennek bemutatása a következő diákon történik meg.

4  olyan lemez kiválasztása amin a telepek száma nem haladja meg a 100-at  a kiválasztott lemez Whatman-féle kromatográfiás papírral történő lefedése (egy órára)  a papírkorong kiszárítása, majd 0,2%-os ninhidrin- oldattal történő lepermetezése Ahol a papír a szabad aminosavat termelő mikroorgaizmus-teleppel érintkezett ninhidrid-pozitív folt jelenik meg.

5  a foltok összevetése a lemezen lévő telepekkel  a kiválasztott mikroorganizmus-telepek izolálása és tisztítása A szabad aminosavak termelését erősen befolyásolja a táptalaj minősége, ezért célszerű a szaporítást párhuzamosan több táptalajon végezni.

6 A szabad aminosavak meghatározása a tápoldatból történik. A tenyésztéshez leggyakrabban használt tápoldatok az Asai, valamint a Kinoshita. A tenyésztendő mikroorganizmustól függően különböző ideig szükséges az inkubációt végezni. Ez baktériumok és élesztőgombák esetében 4-5 nap, mikroszkópikus gombák és sugárgombák esetében 6-8 nap. A kinőtt mikroorganizmusokat centrifugálással választják el a tápoldattól. Kis mennyiségű aminosavak meghatározása előtt el kell távolítani a zavaró vegyületcsoportokat:  fehérjék  lipoidok  szervetlen sók

7 Az oldatot kationcserélő oszlopon H-ciklusban vezetjük át. A savak és az elektromos töltéssel nem rendelkező komponensek áthaladnak az oszlopon, míg az aminosavak megkötődnek rajta. Ezek ammóniával eluálhatóak, a mosással azonban a szervetlen kationok is felszabadulnak. Az oldat mérhetővé tételéhez további előkészületi lépésekre van szükség.

8  az oszlopról távozó eluátum szárazra párolása,  sómentesítés 1%-os sósavtartalmú acetonnal,  az acetonos oldatot bepárlása száraz levegővel,  a bepárlási maradék feloldása 0,5 ml desztillált vízben, majd 0,5 ml éterrel történő mosása (2-3 ismétlés),  a vizes oldat beszárítása exszikátorban, kénsav felett, majd  feloldás 100 µl vízben. Az így kapott oldatból kromatográfiás módszerrel meghatározhatóak az aminosavak.

9 A szabad aminosavakat a talajból extrahálással nyerjük ki, melyre széles körben 80%-os etanolt használnak. Az extrakció lépései:  50g talajt rázólombikba mérünk, majd 75 ml desztillált vizet adunk hozzá.  30 perc rázatás után (rázógép) az oldatot centrifugálással elválasztjuk a talajszemcséktől.  Ha a szupernatáns zavaros, papírszűrőn szűrjük.  Az extrakciót megismételjük 50 ml desztillált vízzel.

10  Ezután az extrakciót elvégezzük 50 ml 80%-os etanollal két ismétléssel, 20 és 15 perces rázatás mellett.  A szupernatánsokat összeöntjük, és vákuumban 30°C- on bepároljuk.  A száraz maradékot kevés vízben feloldjuk, majd választótölcsérben, többszöri kismennyiségű adagolással étert adunk hozzá, a kromatográfiát zavar komponensek eltávolítása érdekében (pigmentek, lipidek stb.)

11  Összerázás után a vizes és éter fázist elválasztjuk egymástól.  A vizes fázist (melyben az aminosavak vannak) vákuum alatt 30°C-on bepároljuk, majd a bepárlási maradékot 1%-os sósav tartalmú vizes acetonban foldjuk.  Összerázzuk, majd a kicsapódó sókat centrifugálással leválasztjuk.  Az oldatot vákuumban bepároljuk, majd a szilárd maradékot 1-2 ml izopropilalkoholban feloldjuk és zárható kémcsőbe öntjük.

12 Az így kapott oldat szabad aminosav tartalmát felszálló kromatográfiás módszerrel mérni tudjuk. A kromatogramokra 30, 50, és 100 µl oldatot viszünk fel. A szabad aminosav tartalmat 1g légszáraz talajra számítjuk át.

13 Forrás: Szegi J.: Talajmikrobiológiai vizsgálati módszerek, Mezőgazdasági Kiadó, Budapest, 1979