Fehérjék, peptidek mintaelőkészítése

Az előadások a következő témára: "Fehérjék, peptidek mintaelőkészítése"— Előadás másolata:

1 Fehérjék, peptidek mintaelőkészítése

2 Miről fogunk tanulni? Proteinek kinyerése komplex mintákból (szövet, fermentlé stb.) Nem protein jellegű szennyezők (lipidek, nukleinsavak, stb.) eltávolítása Protein szennyezők eltávolítása (precipitáció, frakcionálás, szelektív jelölés) Mérésnek megfelelő koncentráció beállítása

3 Analitikai célú (kis térfogatú) vizsgálatok
Proteomika (összetétel, funkció, változás) Klinikai vizsgálatok (kórképek, terápia) Szerkezeti vizsgálatok (mutáció, PTM) Térbeli elhelyezkedés (sejtek közti különbségek)

4 Nehézségek-mielőtt hozzákezdünk
Nagyfokú diverzitás (összetétel, koncentráció) élesztősejt: db/sejt vérszérum: mg/L (3/4 Alb + Ig) mAb: 150 kDa, 108 db elméleti variáns Jól definiált std-ek hiánya Analitikai problémák: 2-3 nagyságrend tartomány (5-12 mintában) felbontóképesség (komponensek száma nagy) érzékenység nem elég (abundáns fehérjék) Minta stabilitása: homeosztázis, proteázok, precipitáció, adszorpció, műtermékek

5 Plazma proteinek

6 Néhány szám-komplexitás

7 NINCS (elfogadható van)
Jó mintaelőkészítési protokoll: univerzális mátrixra, szelektív analátra, nem változtatja meg az analátot NINCS (elfogadható van) Lehetőleg kevés lépésből áll (veszteségek) Tisztázni kell: analitikai cél minta forrása, mennyisége technikák alkalmazhatósága (pl. LOQ) mintaszám: idő/költséigény protokoll kidolgozása (irodalom, tapasztalat, intuíció) legyen több alternatíva

8 Néhány analitikai technika teljesítménye

9 Mintatípusok Nedvek: vér, vizelet, stb. relatíve homogének, alacsony enzimaktivitás, egyszerű kezelés Szövetek: feltárás szükséges, homogenizálás, magas enzimaktivitás, proteinek beoldása Rekombináns sejtek: sejtes elemek feltárása, majd hasonlóan a szövetekhez

10 Minták stabilizálása Fagyasztás folyékony nitrogénben Kémiai/fizikiai denaturáció (sók, szerves osz., T) Stabilizáló enzimek (pl. proteáz inhibitorok) Precipitáció (visszaoldás?) Gyors, kontrollált hőmérsékletű feldolgozás

11 Sejtfeltárás (lízis: lágy, moderált, kemény)
Megfelelő hatásfokú feltárás, a célprotein beoldása Zavaró komponensek kicsapása Frakcionálás: centrifugálás hatásfok Károsodás veszélye

12 Stabilizáció Kémiai, szerkezeti módosulások történhetnek: megelőzés:
Lágy lízis, enzimgátlás (hő: irreverzibilis denat., kémiai: reverzibilis, aktivitás megőrízhető):

13 Stabilizáció 2. Detergensek: SDS, oktil-glikozidok, stb.
Kémiai, szerkezeti módosulások történhetnek: Oxidáció: redukálószer (DTT) Konformációváltozás: fiziológiás extrakció: T: 36°C, pH: mM foszfátpuffer, ionerősség: 0.15 M NaCl Oldatban tartás: Hofmeister-sor (1888, tojásfehérjék) Detergensek: SDS, oktil-glikozidok, stb. precipitál: hidrofób kölcsönhatások erősítése szolvatál: hidrofób kölcsönhatások gyengítése (kaotróp), denaturáció

14 Példa protokoll: szöveti fehérjék vizsgálata
Mintavétel: izomszövet (tárolás: foly. nitrogén) Homogenizálás: fagyasztva őrlés Extrakció: extrakciós puffer, ultrahang Fázisszeparálás: centrifuga (20000g, 20min) Felülúszó további előkészítése, pl. proteolízis Minta vizsgálata

15 Minta vizsgálata (mátrix egyszerűsítés)
Differenciálprecipitáció Prefrakcionálás (IEF, 1-2D SDS PAGE, IEX, SEC, RP) Immunodepletálás (abundánsok eltávolítása) Immunodúsítás (pl. foszfo/gliko stb. proteinek/peptidek) Membránszűrés (3-100 kDa MWCO)

16 Differenciálprecipitáció

17 Dúsítás-sómentesítés MS Gyors (komplexebb minta)
SDS-PAGE Futtatás Festés Kivágás Visszoldás MS Lassú (tiszta minta) SEC Frakciószedés Dúsítás-sómentesítés MS Gyors (komplexebb minta)

18 Immunodepletálás/immunodúsítás

19 Membránszűrés

20 HTS módszerek (sok minta)

21 Szerkezetvizsgálatok-mintelőkészítés (mAb példája)
Intakt fehérjék nehezen vizsgálhatók: LC: diffúzivitás (anyagátadási ellenállás) adszorpció (T, additív, P) MS: tömegtartomány (m/z :Q, ToF) felbontás (Gln:128.14, Lys:128.17; (1500 Da peptid)) Megoldás: karakterizáljuk a peptideket!

22 mAb Szekvencia (de novo szekvenálás) Proteolízis: tripszin (Lys, Arg C-term), pepszin, kimotripszin, Glu-C, stb.. peptidek szekvenálása MS-ben 100% lefedettség kell (nagyon nehéz, több enzimet kell használni) Töltésvariánsok PTM Aggregáció És ez még messze nem elég!!!!

23 proteolízis protein oldat pH beállítás S-S redukálás (DTT), denaturáció (detergens alkilálás (IAA) pH, T beállítás tripszines emésztés: Da peptidek (autoproteolízis gátolt, specificitás?) peptidek (nano)LC-MS/MS

24

25 LC-MS/MS Adatfüggő analízis Target analízis

26

27 Töltésvariánsok: IEC (papain)

28 Oxidált variánsok: RP (DTT)

29 Fragmensek, aggregátumok: SEC

30 Konklúziók Érzékeny, bonyolult minták Többlépéses mintaelőkészítés
Protokollt a feladat határozza meg Költségesebb Nagyobb körültekintést igényel Kisebb reprodukálhatóság Aki jól csinálja, annak lesz munkája