REDOX-POTENCIÁL MÉRÉSEN ALAPULÓ GYORS MIKROBIOLÓGIAI MÓDSZER

Az előadások a következő témára: "REDOX-POTENCIÁL MÉRÉSEN ALAPULÓ GYORS MIKROBIOLÓGIAI MÓDSZER"— Előadás másolata:

1 REDOX-POTENCIÁL MÉRÉSEN ALAPULÓ GYORS MIKROBIOLÓGIAI MÓDSZER
Reichart Olivér Szakmár Katalin

2 Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 1.
Klasszikus (tenyésztéses) módszerek Hosszú inkubációs idő (1-4 nap) A módszerek alkalmazhatósága, megbíz-hatósága és költsége tartományfüggő Nagy koncentrációknál: Hígítás és telepszámlálás a cfu/ml tartományban Alacsony koncentrációknál: MPN módszer Membrán szűrés

3 Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 2.
Gyors mérési módszerek 1. (sejtszámlálás alapján) Direkt számlálás Számlálókamra Flow cytometer Csak tiszta folyadékban alkalmazható Turbiditásmérés

4 Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 2
Gyors mérési módszerek 2. (Anyagcseretermék detektálása alapján) ATP mérés Csak 105 sejt felett alkalmazható Impedancia mérésen alapuló módszerek Malthus Rabit Bactrac

5 Mikrobiológiai minőség-ellenőrzés problémái 3.
Impedimetriás gyors módszerek Nagy pontosságú termosztát-igény miatt nagyon drága berendezés. Speciális, kis vezetőképességű szubsztrátot igényel. Probléma a szelektív szubsztrátokkal. A mérő cellák geometriája és térfogata adott. Kis koncentrációknál megbízhatatlan.

6 Redoxpotenciál mérésen alapuló módszer elvi alapjai
Kémiai reakció általános formában: a A + b B c C + d D [C]c [D]d Q = [A]a [B]b

7 Szabad energia és elektromos munka
DG = DG° + R T ln Q DG = - n FDE. -n F DE = - n F DE° + R T ln Q

8 DE = DE° - ------- ln ---------
Elektromotoros erő R T [C]c [D]d DE = DE° ln n F [A]a [B]b

9 Biológiai rendszerekben
Energiaforrás a biológiai oxidáció, ami a környezetben redukciót eredményez. A környezet redukciójának okai lehetnek: Oxigén elfogyasztása Redukált komponensek feldúsulása Tipikus oxidációs-redukciós reakciók biológiai rendszerekben: [Oxidant] + [H+] + n e- [Reductant]

10 Eh = E0 - ---- ln ------------------- nF [oxidant] [H+]
Nernst egyenlet: RT [reductant] Eh = E ln nF [oxidant] [H+] RT [oxidant] [H+] Eh = E ln nF [reductant] Eh : a normál hidrogén elektródra vonatkoztatott redoxpotenciál (V) E0 : A rendszer normál redoxpotenciálja (V) R: Gáz-állandó R = J/mol K F: Faraday állandó F = 9.648˙104 C/mol (J/V mol) n: elektronok száma a redox-reakcióban (n=1)

11 Mikroba-szaporodás redox-görbéje

12 Különböző baktériumok redox-görbéi

13 A kezdeti sejtszám hatása a redox-görbére

14 Detektációs kritériumok
Impedimetriás módszerek RABIT: admittancia változás > 5 S/6min BACTRAC: impedancia változás > 5% Redox-potenciál mérés: |E/ t|>1mV/min Detektációs idő (TTD): A detektációs kritérium eléréséhez szükséges idő

15 A kezdeti sejtszám hatása a detektációs időre

16 Mérőcella redoxpotenciál méréshez 1.

17 Mérőcella redox-potenciál méréshez 2.

18 Indirekt mérőcella

19 Mérőcella hatása a redox-görbére

20 Enterococcus faecalis különböző cellákban mérve

21 12 csatornás mérő-rendszer
Vízfürdő Mérőcellák Adatgyűjtő Computer Monitor Software for Windows

22 Termékben való közvetlen mérés

23 Termékben való közvetlen mérés

24 16 csatornás mérési elrendezés

25 32 csatornás mérési elrendezés

26 2 csatornás mérési elrendezés

27 Mozaik elrendezésű képernyő

28 Csoportosított gráfok

29 Mérési eredmények megjelenítése

30 Mérési eredmények megjelenítése

31 Mérési módszer validálása

32 Teszt-mikrobák és táptalajok 1.
Microorganisms Redox potential Plate counting Escherichia coli BBL, TSB TSA, Tergitol Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Klebsiella oxytoca Acinetobacter lwoffii Pantoea agglomerans

33 Teszt-mikrobák és táptalajok 2.
Microorganisms Redox potential Plate counting Pseudomonas aeruginosa Cetrimide, TSB TSA, Cetrimide Pseudomonas fluorescens Enterococcus faecalis Azide, TSB TSA, Slanetz-Bartley Total count TSB TSA

34 A módszer validációs jellemzői 1.
Szelektivitás A szelektív médium által adott. Linearitás 1-től 107 cfu/mérőcella.

35 Enterococcus szelektív kimutatása azid levesben

36 Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, E
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, E. coli és Enterococcus faecalis Cetrimid-levesben

37 Enterococcus faecalis meghatározás linearitása

38 Pseudomonas aeruginosa meghatározás linearitása

39 E. coli linearitása lemezöntéssel és membránszűréssel

40 Impedimetriás és redox-módszer összehasonlítása

41 A módszer validációs jellemzői 2.
Érzékenység Kimutatási határ (Detectation limit) 1 cell/test flask. Meghatározási határ (Quantitation limit) Elméleti meghatározási határ 10 sejt/inoculum (1 log egység), ami megegyezik a kapott kalibrációs görbékkel.

42 A módszerek érzékenysége

43 A módszer validációs jellemzői 3.
Tartomány A kalibrációs görbék alpján 1-7 nagyságrend. 10 sejt alatt a Poisson eloszlás okoz problémát, 107 sejt felett a TTD túl rövid a tranziens folyamatokhoz képest (hőmérséklet-, redox-egyensúly, lag-periódus). Ismételhetőség A kalibrációs görbékből számítva: SDlgN = 0.092 SDN = = 1.24 = 24%

44 A módszer validációs jellemzői 4.
Zavartűrés (Robustness) Legfontosabb paraméter a hőmérséklet, amely két módon befolyásolja az eredményeket: szaporodási sebesség hőmérséklet-függése redox-potenciál hőmérséklet-függése A mikroba szaporodási optimumán mérve, a szaporodási sebesség ±0.5 °C intervallumon belül nem változik. A hőmérséklet-ingadozás redoxpotenciálra kifejtett hatása kísérleti eredményeink szerint elhanyagolható.

45 Hőmérséklet hatása a redox-potenciálra

46 A hőmérséklet hatása a mérési módszerekre
Impedimetriás módszerek: A mért impedancia erősen hőmérséklet-függő. A detektációs kritériumok (5µS RABIT-nál, vagy 5% növekedés BACTRAC esetében) már 0.025°C hőmérséklet-változással elérhetőek (RABIT Manual). Ez az oka a szigorú hőmérséklet-szabályozási követelménynek (T=±0.002°C). Redox-potenciál mérés: A mért redox-potenciált döntően csak a mikroba-szaporodás határozza meg. A hőmérséklet-ingadozás hatása elhanyagolható.

47 Impedimetriás és redox mérési módszerek hőmérséklet-érzékenysége
Impedimetric method Redox-potential 1°C változás hatása (Szubsztrát-függő) 20-200S mV Hamis pozitív eredményt adó hőmérséklet-változás 0.004°C/min °C/min Szokásos méréshez tartozó kritikus hőfok-csúszás 0.025°C/6min 7-25 °C/10min

48 A redox-módszer alkalmazása
Víz mikrobiológiai ellenőrzése Össz-mikrobaszám Coliform, E. coli Pseudomonas aeruginosa Enterococcus faecalis Nyers tej mikrobiológiai minősítése Enterobacteriaceae Hús mikrobiológiai ellenőrzése Felületek mikrobiológiai ellenőrzése Penész- és élesztőgombák számának meghatározása

49 Víz mikrobiológiai vizsgálatok Összcsíra

50 Víz mikrobiológiai vizsgálatok Coliformok

51 Víz mikrobiológiai vizsgálatok Pseudomonas aeruginosa

52 Víz mikrobiológiai vizsgálatok Enterococcus faecalis

53 Ipari validálási eredmények 1.
72 palack vizsgálata Coliform mikrobákra Laboratóriumi vizsgálati módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra. Tenyésztés Tergitol agaron (37 °C, 48 h). 1 Petri csészén 3 palack egyesített eredménye. Eredmény: 48 óra. Redox-potenciál mérési módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra. 4 membrán behelyezve 1 mérőcellába, BBL levesbe. Mérés: 37 °C. 1 cella 12 palack egyesített eredményét tartalmazza. Eredmény: 12 óra Kontroll: 1 ml Citrobacter freundii szuszpensio (lgN = 3.66)

54 Ipari mérések eredménye 1.

55 Ipari mérések eredménye 1.
72 palack vizsgálata coliform mikrobákra Minták 1.-12. Laboratory negative Redox

56 Ipari validálási eredmények 2.
66 palack vizsgálata Coliform mikrobákra Laboratóriumi vizsgálati módszer Membrán szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra. Tenyésztés Tergitol agaron (37 °C, 48 h). 1 Petri csészén 3 palack egyesített eredménye. Eredmény: 48 óra Redox-potenciál mérési módszer Membran szűrés: 3x250 ml ásványvíz 1 szűrőlapra. 3 membran behelyezve 1 mérőcellába, BBL levesbe. Mérés: 37 °C. 1 cella 9 palack egyesített eredményét tartalmazza. Eredmény: 12 óra. Kontroll: 1 ml Citrobacter freundii szuszpenzió (lgN = 6.66)

57 Ipari mérések eredménye 2.

58 Ipari mérések eredménye 2.
66 palack vizsgálata coliform mikrobákra Minták Bottles Water sample 1. Water sample 2. Laboratory results negative Redox method

59 Nyers tej össz-mikroba száma

60 Enterobaktériumok tejben

61 Nyers hús össz-mikroba száma

62 Enterobacteriaceae húsban

63 Felületi tamponos vizsgálatok

64 Redox-potenciál változás gombák szaporodása során (indirekt mérés)

65 Saccharomyces cerevisiae kalibrációs görbe

66 Aspergillus niger kalibrációs görbe

67 A redox mérési módszer előnyei 1.
Egyszerű mérési technika. Nem igényel szigorú hőmérséklet-szabályozást. Gyors módszer, különösen nagy mikroba-számú fertőzések esetében. Bármely tápleves alkalmazható (impedimetriás mérések kis vezetőképességű, speciális tápleveseket igényelnek). Különösen alkalmas membrán-szűréses módszer kiértékelésére.

68 A redox mérési módszer előnyei 2.
Gazdaságos, hatékony és egyszerű módszer pusztulás-kinetikai mérések kiértékelésére. Nagyon hatékony módszer táptalaj-optimalizálási kísérletekhez. A vizsgálatok költsége kisebb a klasszikus módszerekhez viszonyítva, különösen null-toleráns mikrobák (coliforms, Enterococcus, Pseudomonas, etc.) meghatározásánál