A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK

Az előadások a következő témára: "A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK"— Előadás másolata:

1 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK 1970 – A molekuláris biológia forradalmának kezdete A Haemophilus influenzae restrikciós endunuklázának felfedezése Három fő csoport I típus  Specifikus szekvenicákat ismer fel, de elvándorol a DNS-en (~ bázis) mielőtt az egyik szálat elhasítja, nukleotideokat szabadít fel (~75) a hasítás helyén. Egy másik endonuckleáz kell a második szál hasításához Pl. EcoK. Mg2+, ATP és SAM (S-adenosyl methionine) SAM kell hozzá

2 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN HASZNÁLATOS ENZIMEK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK II típus  Speciális célszekvenciát ismer fel és hasítja a DNS-t mindkét szálon a felismerési szekvenciában vagy annak környezetében pl. EcoRI Mg2+ kell Ez a típus az elterjedt III. típus  I és II. Kombinációja. Mindkét DNS szálat hasítja egy meghatározott távolságra a felismerési szekvenciától plHgaI Mg2+-t ésATP-t igényel

3 A NUKLEINSAVAK MANIPULÁCIÓJA SORÁN
HASZNÁLATOS ENZIMEK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK Enzim Felismerőhely hossza Felismerő-hasítóhely Forrás organizmus AluI 4 AG/CT Arthrobacter luteus HphI 5 GGTGAN8/ Haemophilus parahaemolyticus EcoRI 6 G/AATTC Escherichia coli BamHI 6 G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens Ragadós végeket adó hasítások (sticky end) 5' túlnyúló Sal I 6 5' G TCGAC 3' 3' CAGCT G 3' Streptomyces albis 3' túlnyúló Kpn I 6 5' GGTAC C 3' 3' C CATGG 5' Klebsiela pneumonia Tompa végű hasítások (blunt end) Hae III 4 5' GG CC 3' 3' CC GG 5' Haemophilus aegyptus

4 Palindrom példák KIS EREK MENTÉN LÁP SÍK ÖLÉN ODA VAN A BÁNYA
RABJA JAJ BARANYÁBAN A VADON ÉLŐ KIS PÁLNÉT NEM KERESIK

5 FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL
Isoschisomers AtcI ' GGTAC/C 3' KpnI ' GGTAC/C 3' XmaI ' C/CCGGG 3' SmaI ' CCC/GGG 3' Kompatibilis véget adó enzimek SalI ' G/TCGAC 3' XhoI ' C/TCGAG 3' FEHÉRJE TÚLTERMELTETÉS SZEMPONTJÁBÓL KITÜNTETT ENZIMEK AflIII ' A/CPuPyGT 3' BspHI ' T/CATGA 3' NcoI ' C/CATGG 3' NdeI ' CA/TATG 3'

6 DNS METILÁZOK - dam metiláz (dezoxiadenin metiláz)
5’ GATC 3’ felismerő hely N6 pozícióban metilez adenin sok dam metiláz érzékeny enzim van pl. MboI, XhoI, egyenként ellenőrizni kell, érzékenység esetén - dam- törzs használata - nem érzékeny izoskizomer használata (ha van) (MboI - Sau3AI)

7 dcm metiláz (dezoxicitozin metiláz)
5’ CCAGG 3’ vagy 5’ CCTGG 3’, C5 pozícióban metilez - hasonlóképpen léteznek dcm metiláz érzékeny enzimek - megoldás ugyanaz, mint a dam esetén citozin Sok metiláz van még, hasonló felismerő kanonikus szekvenciával, mint a restrikciós enzimek pl. M. EcoRI metiláz

8 Polimerázok DNS függő DNS polimerázok RNS függő DNS polimerázok
Templátfüggetlen DNS polimeráz DNS függő RNS polimeráz 5’  3’ polimeráz aktivitás

9 DNS függő DNS polimerázok

10

11 DNS jelölés, nick transzláció

12

13 Templát független DNS polimeráz

14 RNS függő DNS polimeráz

15 A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tud összekapcsolni, ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni

16 DNS ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZIS
denaturáló nem-denaturáló lúgos, (DNS, agaróz) formaldehid, glioxál, DMSO (RNS, agaróz) urea (DNS, akrilamid) Nincs roncsoló ágens méret > 50 kb 100bp-50 kb < 1000 bp Mátrix agaróz agaróz % poliakrilamid technika pulzáló gélelektroforézis hagyományos gélelektroforézis (5-20%) hagyományos LÁTHATÓVÁ TÉTEL: etídium bromid, interkaláló festék Þ nem-denturáló körülmények, elsőősorban duplaszálú DNS-t fest, de egyszálú nukleinsavakat is. A DNS 254 nm-en elnyel Þ energia a festékre Þ 590 nm-en emisszió, a festék maga 302 és 366 nm-en nyel el Lehet gélbe rakni, utófesteni, illetve a mintához adni. Érzékenység kb 10 ng Egyéb festékek, fluoreszkáló anyagok: pl. fluoreszcein, minden körülményközött radioaktivitás: minden körülmény között, 35S, 33P, 32P beta sugárzók .

17 Horizontális gélelektroforézis

18 DNS IZOLÁLÁSA GÉLBŐL - közös pont: először elektroforetikus úton elválasztjuk a DNS-t - a megfelelő sávot kivágjuk steril pengével AGARÓZ dialízis, dializáló hártyában, elektrodialízis a kapott DNS további tisztítása fenolos extrakcióval, alkoholos kicsapással, univerzális, széles mérettartomány - fagyasztásos módszer : a kivágott – DNS-t tartalmazó - agarózdarabot –80oC-on megfagyasztjuk az agarós szerkezete roncsolódik, ebből a DNS egy szűrőn keresztül centrifugálással kinyerhető további tisztítás szükséges, univerzális - kromatográfiás módszerek 6M NaI mellett a DNS 55oC-on (az agaróz megolvad) szilikagél felületére kötődik, a mátrix mosása után innen o55 C-on alacsony só(víz, TE) eluálható, majdnem univerzális, elég széles mérettartomány DEAE membránba futtatjuk a DNS-t, innen magassókoncentrációval (1.5M) magas hőmérsékleten eluálható nagy tisztaság, szűk, alacsony mérettartomány < 1.5 – 2 kb esetén jó a kitermelés POLIAKRILAMID (PAGE) a kivágott darabot passzív módon vagy elektromos térben eluáljuk majd töményítjük, ioncserésen tisztítjuk

19 Klónozás fogalma ligálás vektor
Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségével gazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunk Szubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása vektor Hasítás, A,B enzimekkel Hasítás, A,B enzimekkel A inszert A B ligálás B Transzformálás, felszaporítás, tisztítás Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni, Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb.

20 Figure 20.2 Bacterium Bacterial chromosome Plasmid
Cell containing gene of interest Recombinant DNA (plasmid) Gene of interest DNA of chromosome Recombinate bacterium Protein harvested Basic research on protein Copies of gene Basic research on gene Gene for pest resistance inserted into plants Gene used to alter bacteria for cleaning up toxic waste Protein dissolves blood clots in heart attack therapy Human growth hormone treats stunted growth Protein expressed by gene of interest 3

21 KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT
VEKTORTÍPUSOK inszert méret példa plazmidok pUC18,19 < kb fonalas fágok mp18, 19 < kb fagemidek pBluescriptKS, SK± < kb l fágok EMBL3,4 néhányszor 10 kb kozmidok pHC79 néhányszor 10 kb néhány 100 kb BAC, YAC pBAC108L, pYAC3 BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome PLAZMIDOK replikációs origo ORI rezisztencia marker Cirkuláris kettősszálú extrakromoszómális elemek

22

23 Egy ősi plazmid: pBR322

24 Magas kópiaszámú változat: pUC19

25 Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása
antibiotikum rezisztencia, ld. pBR3222, két antibiotikum, az egyik elromlik, ha inszert épül be, fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel hosszú fáradtságos polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus gyors ha nincs más szelekció kék fehér színszelekció, pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron, az inszert beépül, elrontja a gént  megszűnik a letalitás auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén

26 Kolónia hibridizáció

27 LacZ a komplementáció F' plazmidon: defektív b- galaktozidáz gén, hiányzik aminosav közötti régió bevitt vektor: tartalmazza a lacZ szabályozó régiót és az aminosavat a kettő együtt: aktív b – galaktozidáz  X-gal szubsztráttal kék telep a bevitt N-terminális fragmentben : polilinker régió (leolvasási keret marad) ebbe lehet klónozni fragmentumot, ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el  X-gal szubsztráttal kék telep, ha elromlik vagy nagy fragment  X-gal szubsztráttal fehér telep

28 PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI
1. Kémiai transzformálás Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejt A sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat (Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük, sejtfal permeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá transzformációs hatékonyság: transzformáns /µg DNS elvi szám a transzformációt  1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre : normál érték: 106 – 108 nagyon jó: 109 a transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők: oldatok edények tisztasága, - sejtek növekedési sebessége, a növesztés fázisa, hőmérséklete hősokk hőmérséklete hossza permeabilizáló faktor a lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkulárisé egyéb fogások: spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében és ezt transzformáljuk - a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt

29 Elektroporáció A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines (nagy ellenállású  600 ) pufferben szuszpendáljuk nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-ig transzformációs hatékonység x jobb (1010/µg DNS) sejttípusonként optimalizálni kell maghatározó faktorok: - az oldat ellenállása - az impulzus nagysága, hossza - permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása

30 a középső, centrális régió eltávolítható
A  fágok általános felépítése  genetikai anyag: kb duplaszálú lineáris DNS  fertőzéssel jut a sejtbe,  nagy hatékonyság  két életciklus: - lizogén: a fág genetikai anyaga beépül a kromoszómába, a sejt túlél - lítikus: érett fág képződése során a sejtek lizálnak elpusztulnak  a végeken ragadós. ún. ’cos’ végek bal kar 20 kb centrális régió 14 kb jobb kar 9 kb cos a középső, centrális régió eltávolítható EcoRI BamHI SalI

31

32 Speciális λ fág fajták

33 Mesterséges kromoszómák:
BAC (bacterial artificial chromosome) vektorok

34 Mesterséges kromoszómák: YAC (yeast artificial chromosome) vektorok

35 KÖNYVTÁRAK TÍPUSAI - genomiális
a teljes genomból készül, elvileg minden információt tartalmaz (pl. nem transzlálódó régió, szabályozó régiók, intronok) mind prokariótákból, mind eukariótákból - cDNS az aktívan termelődő mRNS-ekből készül csak az érett mRNS szekvenciáját tartalmazza (nincs intron szabályozó régió stb) csak eukariótákból expressziós a cDNS-eket ún. expressziós kazettába klónozzuk, ezáltal a kódolt fehérje (ha a mRNS kódol ilyet) aktívan termelődhet Követelmények a könyvtárakkal szemben - fedje le a teljes genomot, illetve mRNS populációt - ne legyen redundáns

36 in vitro pakolás: összekeverés l fágfehérje extraktummal
GENOMIÁLIS KÖNYVTÁR KÉSZÍTÉSÉNEK SÉMÁJA hasító helyek bal kar jobb kar centrális régió emésztés részleges vagy kb méretű teljes emésztés fragmentek bal kar jobb kar ligálás konkatamer in vitro pakolás: összekeverés l fágfehérje extraktummal A pakolódás feltétele, hogy a rekombináns gemon mérete a vad típus méretének 79 – 105 %- a lehet.

37 A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények
cDNS könyvtár A mRNS-ekkel szemben támasztott követelmények  Integritás  A mRNS mérete, degradált-e Megoldás: denaturáló gélelektroforézis (várt méret kb, a többség kb)  Lehet-e teljes hosszúságú cDNS-t szintetizáltatni Megoldás: elõzetes reverz transzkripció jelölt nukloetidokkal elektroforézis  Lehet-e nagy molekulasúlyú fehérjéket in vitro szintetizálni Megoldás: in vitro transzláció jelölt aminosavakkal  A kérdéseses fehérjét tudjuk-e szintetizáltatni Megoldás: in vitro transzláció + immunoprecipitáció

38 cDNS-könyvtár készítése primer adapter módszerrel

39 RENDELKEZÉSRE ÁLLÓ VAGY SZÜKSÉGES INFORMÁCIÓK A KERESETT FEHÉRJÉRŐL, ILLETVE GÉNJÉRŐL
- nem tudunk semmit - ismeretek a fehérje funkciójáról csak fenotípus alapján jellemezhető mutagenezis (transzpozon) kromoszomális séta van tisztított fehérje fehérje funkció tesztelhető expressziós könyvtárak fehérje szekvenálás DNS próba tervezés ellenanyag termeltetés már van ilyen fehérje illetve gén más típusú sejtekből heterológ próba használata könyvtárak átvizsgálásához EGYÉB pl. ha a fehérje szabályozása ismert  szubsztraktív hibridizáció - számítógép, adatbankok genom szekvenálások

40 A POZITÍV KLÓNOK TOVÁBBI FELDOLGOZÁSA
A könyvtárakból kapott klónok általában túl nagyok közvetlen felhasználáshoz, ezért további munkálatok szükségesek: 1. AZ INSZERT RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉSE   2. A TÉRKÉP ALAPJÁN AZ INSZERT KISEBB DARABOKBAN TÖRTÉNŐ SZUBKLÓNOZÁSA    3. AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA 4. AZ INSZERT SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA 5. SZÁMÍTÓGÉPES ADATFELDOLGOZÁS A SZEKVENCIÁN BELÜLI GÉNEK, ELEMEK AZONOSÍTÁSA

41 RESTRIKCIÓS TÉRKÉPEZÉS

42 Klónozás, szubklónozás
A A B C vektor Hasítás, A,B enzimekkel Hasítás, A,B enzimekkel A inszert A B ligálás B Transzformálás, felszaporítás, tisztítás

43 AZ SZUBKLÓNOK SZEKVENCIÁJÁNAK MEGÁLLAPÍTÁSA

44 FEHÉRJE TERMELTETŐ RENDSZEREK
PROKARIÓTÁK E. coli ismert, Bármilyen fehérje, feltéve, ha - nem túl nagy - nem túl kicsi - nem túl hidrofób - nincs túl sok cisztein benne szekréciós rendszere minimális Bacillus subtilis jól ismert, ha nem is annyira, mint az E. coli van szekréciós rendszere EUKARIÓTÁK emlős sejtvonalak minden fajta fehérje termeltethető bennük tranziens expressziós rendszerek viszonylag gyors, de korlátozott lehetôségek, stabil expressziós rendszerek hosszú, fáradságos optimalizálást igényel élesztő gyorsan szaporodó eukarióta sejtvonal, sok ismeretanyag viszonylag könnyű kezelhetőség poszttranszlációs modifikációk lehetősége

45 PROKARIÓTA EXPRESSZIÓS VEKTOR ELEMEI
SZF TSZE GS Pr  SD kódoló szekvencia TT -35 -10 STOP kodon UAAU UGA UAG TTGACAN17TATAAT START kodon AUG GUG UUG 5’ UAAGGAGGN(3-11) AR ORI Pr: promóter TT: transzkripciós terminációs szignál, SZF: szabályozó fehérje,, TSZE: transzlációt szabályozó elemek, SD: Shine-Dalgarno szekvencia, AR: antibiotikum rezisztencia, ORI: replikációs origo GS: gazdasejt

46 cDNS-ből készült expressziós könyvtárból
- Immunológiai detektálás poli- vagy monoklonális ellenanyaggal   - Aktivitás mérés (csak bizonyos szerencsés esetekben)   - Valamilyen módon jelölt liganddal (ha van a keresett fehérjének)

47 Polimeráz láncreakció I.
Termostabil DNS polimeráz, Taq, Pfu, Vent, Pwo stb. Soknak nincs 3’  5’ exonukleáz aktivitása  “A” túlnyúló

48 Polimeráz láncreakció II.

49 A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI I.
- FERTŐZÉSEK KIMUTATÁSA minden élőlény genetikai anyaga nukleinsav, ez tartalmaz specifikus szekvenciaelemeket  speciálisan tervezett primerek segítségével PCR a termék megjelenése fertőzésre utal

50 Pontmutációk kimutatása RFLP-vel.
Rerstrikciós fragment length polimorfizmus Figure 20.9a, b Normal  -globin allele Sickle-cell mutant -globin allele 175 bp 201 bp Large fragment DdeI 376 bp DdeI restriction sites in normal and sickle-cell alleles of -globin gene. Electrophoresis of restriction fragments from normal and sickle-cell alleles. Normal allele Sickle-cell allele 201 bp 175 bp (a) (b)

51 A PCR DIAGNOSZTIKAI ALKALMAZÁSAI II. MUTÁCIÓK KIMUTATÁSA
normális C gén mutáns 5' 3' A C 5' 3' PCR egészséges nincs termék beteg

52 Centrális dogma és a bioinformatika főbb területei a molekuláris biológiában
DNS Gén transzkripció, RNS szerkesztés RNS transzkriptomika degradáció transzláció, poszttranszlációs módosítás proteomika fehérje degradáció biokémiai aktivitás metabolikus útvonalak metabolomika

53 Genom szekvenálási stratégiák
Shotgun Primerséta

54 Alternatív shotgun stratégiák
térképezés: -genetikai:gének,tulajdonságok pozícionálása -fizikai:szekvenciák,gének rendeződése

55 …GACTTCATCGGTATCGAACT…
Genom térképezés fajtái Cytogenetic map Chromosome banding pattern and location of specific genes by fluorescence in situ hybridization (FISH) Genetic (linkage) mapping Ordering of genetic markers such as RFLPs, simple sequence DNA, and other polymorphisms (about 200 per chromosome) Physical mapping Ordering of large over- lapping fragments cloned in YAC and BAC vectors, followed by ordering of smaller fragments cloned in phage and plasmid vectors DNA sequencing Determination of nucleotide sequence of each small fragment and assembly of the partial sequences into the com- plete genome sequence Chromosome bands Genes located by FISH Genetic markers Overlapping fragments …GACTTCATCGGTATCGAACT… 1 2 3 Figure 20.11

56 A gének eloszlása nem egyenletes
Staining techniques used to produce chromosome banding patterns Technique Procedure Banding pattern G-banding Mild proteolysis followed by staining with Giemsa Dark bands are AT-rich Pale bands are GC-rich R-banding Heat denaturation followed by staining with Giemsa Dark bands are GC-rich Pale bands are AT-rich Q-banding Stain with quinacrine Dark bands are AT-rich C-banding Denature with barium hydroxide and Dark bands contain constitutive then stain with Giemsa heterochromatin

57 Southern blot és hibridizáció

58 EST: expressed sequence tag
Restrikciósfingerprint RepetívDNSfingerprint KlónozottDNSfragmentumok EST: expressed sequence tag STS: sequence tagged site egyedi bp fragment

59 Bakteriális shot-gun könyvtár készítése
E. coli transzformálás elektroporálás kromoszómális DNS nebulizátor 2-3,5 kb fragmentek végek tompítása defoszforilálás összetört DNS Preparatív gél elektroforézis

60 A szekvenciák feldolgozása
szekvenciaanalízis ellenőrzés, validáció Phrap SeqMan/DNASTAR STADEN programcsomag Vektor és egyéb szennyező szekvenciák eltávolítása Vector_clipping Gyenge minőségű szekvenciák eltávolítása Phrap Átfedő fragmentumokból kontigok összerakása Phred

61 De ha sikerül, és van szekvenciánk
Mi van rajta,van-e gén? Honnan tudjuk, hogy Valamit találtunk, találtunk-e gént? CTCGAGACGCTGTTTCTGGGGTCATTCATTCTTGGCGGGCTGCAACTGCTGGTGTGACCGACGCGACCTGGCAGGCCGCGGTGCGCAACTGGCCGGGCGGACTAATGGTGGAGCAAAAGA TCGGCATGTCCAGCGCACCTGAAGCTTGGGTGGTTGCTGCAATAGCAGCCTTCCTTATTGGCATGGCGAAGGGCGGTTTGGCCAATGTGGGGGTTATCGCCGTTCCCTTGATGTCCCTGG TCAAGCCGCCGCTTACCGCTGCCGGATTGCTGCTCCCGATCTATGTCGTTTCTGATGCATTCGGCGTCTGGCTTTATCGGCACCGGTATTCTGCCTCCAATCTGCGCATCCTGATTCCTT CGGGATTTTTTGGGGTCCTGATTGGCTGGTTATTGGCCGGGCAGATCTCCGACGCGATTGCCAGTGTCATTGTTGGTTTCACCGGCTGCGGCTTCGTGGCTGTGCTGCTGGCACGACGAG GGGTGCCATCGGTGCCGCGTCAAGCCAACGTGCCCAAAGGATGGTTTCTGGGGGTGGCCACCGGCTTTACCAGCTTTTTGACTCATTCCGGTGCGGCGACCTTCCAGATGTTCGTGCTGC CGCAACGGCTGGACAAGACCATGTTCGCGGGCACATCAACGCTTACCTTTGCTGCCATAAACCTATTCAAGATTCCGTCCTACTGGGCATTGGGACAGCTTTCGACTTCCTCGGTCATGT CCGCGCTAGTGTTGATTCCGGTGGCCGTGGCCGGGACGTTCGCAGGTGTTTTTGCGACGCGCAGGCTATCGACATCCTGGTTCTTCATTCTGGTCCAGGCGATGTTGCTGGTGGTCTCCA TTCAGCTTCTGTGGAGGGGAATGTCGGATATCCTGAACTAGCTGGAGATCGCAATGTCAGAACGCTCAATCAATCAGAATGTAATCTTGACATAGAATACCGTTCCGATTTATTGCTTCG AGTGAAGCTGCCCGTCCGCTGAGATGTCATGACATTTTCCCCGCTTGATTCCGCCCTGCTTGGACCGTTGTTCGCGACCGATGAAATGCGCACGGTCTTCTCCGAACGGCGTTTTTTGGC GGGAATGCTTCGTGTTGAAGTGGCCCTGGCGCGCGCGCAGGCGGCAGAGGGCCTTGTCAGTTCGGAATTGGCCGACGCGATCGAGGTTGTTGGTACTGCCGGGTTGGACCCCGAGGCGAT GGCGGCGACTACTCGCATGACAGGAGTGCCCGCAATATCGTTCGTCCGTGCGGTGCAATCGGCCCTGCCGCCCTCACTGGCGGGTGGATTTCATTTCGGCGCCACCAGTCAAGACATCGT GGATACGGCCCACGCGCTCCAGCTGGCCGAGGCACTCGATATTATAGAAGTCGATTTACACGCCACTGTCAGCGCAATGATGAATCTGGCCGCTGCTCACTGCAATACACCCTGTATCGG GCGCACGGCCTTGCAGCACGCAGCGCCAGTTACGTTCGGCTACAAGGCGTCCGGCTGGTGCGTTGCCCTGGCGGAGCATCTGGTGCAGCTTCCCGCGCTGCGAAAGCGGGTTCTGGTGGC GTCGCTAGGGGGGCCGGTTGGTACCCTTGCCGCGATGGAGGAGCGGGCCGACGCTGTACTGGAGGGTTTCGCTGCGGACCTGGGGTTGGCCATTCCCGCCCTGGCCTGGCACACGCAGCG GGCCCGGATCGTCGAGGTGGCCAGTTGGCTGGCCATATTGCTGGGAATTCTGGCAAAAATGGCCACCGATGTCGTTCACTTGTCCTCCACGGAAGTGCGCGAGCTTTCCGAACCTGTAGC GCCGGGCAGGGGGGGCTCCTCGGCGATGCCTCACAAGCGGAACCCGATTTCCTCGATTACCATCCTGTCCCAGCATGCTGCGGCAGGGGCCCAGCTCTCCATTCTCGTGAACGGCATGGC CAGTCTGCACGAACGTCCGGTGGGGGCGTGGCATTCGGAATGGTTGGCTCTGCCGACGCTGTTCGGCCTTGCCGGCGGTGCCGTGCGCGAGGGCAGGTTTCTGGCCGAGGGGCTGCTGGT CGATGCCGACCAGATGGGTCGCAATCTACAATTGACCAATGGCCTGATTTTCAGCGACGCGGTAGCCGGCCAGTTGGCAAAGCACTTGGGTCGGGCCGAGGCTTATGCCGCTGTCGAGGA TGCCGCCGCCGAGGTGTTGCGTTCAGGCGGCAGCTTTCAGGGTCAGCTGAACCAGCGCCTGCCCGATCACCGCGACGCTATCGCTATTGCTTTTGATACGACGCCGGCGATCCAGGCCGG GGCCGCCCGCTGCCGTAGTGCGCTGGATCATGTGGCTCGTATTCTTGGACCCGCCTCTACCATCGGATTTCAAGGAGGCTAATGACGTGACGACACTGTTTGAGGCGACGACCATCCCGA TTTGCGAGGGCCCGCGCGACCAGACCGCCGAGATCCTTTTCGAGATGCCGCCGGGTGCGTGGGATACCCATTTTCATGTTTTTGGCCCAGTTTCATCGTTTCCATACGCAGAACACAGGC TCTATTCCCCACCGGAGTCGCCACTTGAGGATTATCTGGTGTTGATGGAGGCTTTGGGGATCGAGCGCGGCGTTTGTGTCCATCCGAATGTTCATGGTGCCGACAATTCGGTGACGCTCG ACGCAGTTGCGCGGTCCGATGGTCGTCTGCTGGCGGTGATCAAGCCACATCACGAGATGACTTTTGTTCAGCTGCGGGACATGAAGGCGCAGGGGGTCTGCGGGGTACGTTTTGCCTTCA ATCCGCAGCATGGCTCGGGCGAGTTGGATACTCGTTTGTTCGAGCGTATGTTGGACTGGTGCCGCGACCTAGGCTGGTGCGTAAAATTGCATTTCGCGCCCGCTGCGCTGGACGGTCTGG CTGAACGTTTGGCGCGCGTCGATATTCCGATCATCATCGATCATTTCGGGCGGGTGGACACCGCGCAAGGTGTGGATCAGCCGCACTTCCTGCGTTTGCTCGATCTGGCCAAACTGGACC ATGTCTGGATCAAGCTTACGGGGGCAGATCGTATTAGCGGTTCCGGCGCGCCATATGACGATGTCGTGCCCTTCGCGCACGCTTTGGCAGATGTGGCGCCCGACCGCCTCCTCTGGGGTT CGGATTGGCCGCATTCAGGCTATTTCGATCCGAAGCACATACCCAATGACGGCGACTTGTTGAACCTTTTGGCGCGTTTTGCCCCCGATGCTGAACTGCGTCGTAAGATCCTTGTGGACA ACCCGCAGCGCCTGTTCGGGGCTGCTTGAGGAGCCGAGCCGATGCAACCTTTCGTCTACGAAACAGCCCCAGCGCGCGTCGTTTTCGGGCGCGGCACTTCGCAGAATCTGCGGCGGGAAC TTGAGGCCCTGAATTTTGGCAGGGCGCTGGTTCTTTCCACGCCCGACCAAAAAGAACAATCGCTGCGAATTGCCCAGGGCCTGGGTTCTCAGCTGGCGGGGTCGTTCCACGCCGCTGCCA TGCATACGCCTGTCGAGGTCACCTTGCAGGCGCTTGAGGTGCTGAAGGATGTGCAGGCCGATTGCATCGTGGCGATTGGCGGCGGCTCAACCATTGGGTTGGGCAAGGCACTGGCCCTGC GCACCGATCTGCCGCAGATCGTCGTCCCGACGACTTATGCCGGCTCGGAAATGACGCCGATCCTGGGAGAGACGGAAAACGGGCTGAAGACCACACAGCGTAATCCCAAAGTGCAGCCGA GGGTGGTTCTCTACGATGTGGACCTGACTGTGACGCTTCCGGTGCAGGCCTCGGTTACATCAGGCATGAATGCGATCGCCCATGCGGCCGAGGCATTATATGCGCGGGACGGCAATCCGG TGATCTCGCTGATGGCCGAAGAGGCGATCCGCGCGCTGGCCCATGCCCTGCCGCGTATCGTTGCCACTCCCGACGATATCGAAGCGCGCAGCGATGCCCTCTATGGCGCGTGGCTGTGCG GAACGTGCCTGGGTTCGGCCGGAATGGCGTTGCACCATAAGCTCTGCCACACCCTCGGCGGAAGTTTCGATTTGCCACATGCCCCGACCCACACGGTCATCCTCCCCTATGCGCTCGCCT ATAATAGTGATGCGGCCAGGCCCGCAATGGCAGCCATCGCGCGCGCGCTGGGCATGGCGGATGCAGCGATGGGCATGAGAGCGTTGTCCATGCGGTTGGGCGCCCCGACATCGCTGCGTG AGTTGGGCATGGCAGAAGCCGATCTTGACCGCGCCGCCGACCTGGCCACGCAAAATGCCTATTGGAACCCGCGACCCATCGAGCATGGGCCGATTCGTAACCTTCTGGGACGGGCCTGGG CTGGAACTCCGGTCTGAAGGACCTAGAGGACAGTCAATTCATTGATCTGAAGTCACCAACGAGGAGATATGGGATGAACGAGAACATTGCGATCCGCAAATTGGGCCGCCGACTCCGATT GGGCATTGCCGGTGGCGCGGGTCATTCGCTGATTGGTCCGGTTCACCGGGAGGCGGCTCGGCTTGACGATTTGTTCTCTCTCGATGCTGCGGTGCTGTCCAGTAACGCGGAACGCGGGGA TGCTGAGGCCGCGGCTCTCGGAATTCCGCGCTCCTATTCGTCCACCGCCGAGATGTTCGCAATGGAGAAGGCTAGGCCCGACGGTATTGAGGCCGTTGCCATAGCCACGCCGAATGACAG CCATTACCGGATTCTGTGCGAGGCGCTGGACGCCGGGTTGCATGTAATCTGCGACAAGCCTTTAACCTCCACGAAGGCCGAGGCCGACGACGTGCTGGTGCGGGCGAAGGCCGCGGGCAA GGTTGTGGTCCTGACCCACAATTATTCTGGCTACGCCATGGTACGCCAAGCCCGCGCCATGGTCGCCGCCGGTGAACTTGGGAAAATCCACCAGATTCACGGGGTCTACGCTCTGGGCCA GATGGGCCGTTTGTTCGAGGCCGACGAAGGGGGCGTGCCTCCGGGGATGCGTTGGCGGATTGATCCTGCGCGCGGTGGCGACAGTCACGCCCTGGTGGATATCGGCACCCATGTGCACCA TCTGGCTACCTTCATCACGCAGTTACAGGTCGTTGAGGTAATGGCCGATCTTGGGCCGGCGGTTCAAGGCCGCGCGGCCCATGACAGTGCCAACGTCATGTTCCGTATGGAAAACGGAGC TTTCGGATCGTTCTGGGCCACCAAGGCGGCATCGGGGGCCAGCAAGCTGGCGATCGAAGTCTACGGTGACAAGGGCGGCGTCCTGTGGGAGCAGGCCGACGCCAATAACTTGCTACATAT GCGGCAGGGCCAACCCCCAGCCCTGATTGGTCGACAAGTTGCCGGGCTGCATCCTGCGGCAATCCGCGCGATGCGGGGGCCGGGTTATCATTTCGTGGAAGGCTATCGCGAGGCCTTTGC GAATATGTACGTGGATTTCGCCGAACAGATCTTGGCCATGATGGGCAAGGGGGCCGCAGATCACCTGGCATTGGAAGCGCCGTCGGTCGTGGACGGCCTGCGCTCCATGGCGTTCATCGA AGCCTGTGTGGCGTCGTCGCAGGACCGCCAATGGCGGCAGGTGGAGCAAGTCAGTTGATCTCTCAGCGGCTTCGGCATTTTTCCCGGGCTGGCGGCTCCCCGCAGCTCCCTCCGGTGGAA AGAACGGGTAATCAAAATAATATTCTGATTTTAAAGGATGTTCCAGACAGCTGATTATTCCTGAAATTTAGGGCTCTTTCGGCTGTAGCAATTGACTAAAAGCCGAATTTAAGGGTAATTAAACAAACGCTGTTCGTATTATTTAAACAGGTGAGTGATGGCGATATTCCTGGAAGGCTGGCCGATGGTTTCATCTGAATACCCGGCCAGAAGCGTTGAGGCGCACCCGGCCTATCTGAC GCCAGACTATGTTTTCACGCGAAAGCGTGCGCCGACTCGACCGCTGCGGTTAATTCCTCAGTCTGCGACGGAGCTGTATGGCCCGGTTTATGGACAAGAGAGCGTCCGTCCGGGGGATAA CGACCTGACCCGTCAGCACGAAGCTGAGCCGGTGGGGGAGCGGATTCTGGTGACGGGGCGCGTGACCGACGAAGACGGGCGGGGTGTCCCTAATACGCTGCTAGAGATCTGGCAGGCCAA TGCCGCCGGTCGCTATATCCACAAGCTTGACCAGCATCTTGCCCCGCTTGATCCAAATTTCTCGGGGGCAGGGCGTACGGTTACGGGGGCTGATGGCTCTTATTCCTTCATCACGATCGT GCCGGGCGCCTATCCGGTCGTGGGGCTGCACAATGTCTGGCGCCCGCGCCACATCCATGTGTCGTTGTTCGGTCCGTCCTTCGTGACCCGCTTGGTTACCCAGATATATTTCGAGGGCGA TCCGCTGCTGAAATATGACACGATCTACAACACGGCGCCCGACATCTCGAAGCGCAGCATGGTGGCGCAGTTGGACATGGGCGCCACGCAATCCGAATGGGGCCTGACCTATCGCTTCGA CATCGTTCTGCGTGGGCGCAACGGCAGCTATTTCGAGGAACCCCATGACCACTAAGACCCCACTGACCATCACCCCCTCGCAGACTGTCGGGCCTTTCTATGCCTATTGCCTGACCCCGG AGGACTACGGGACGCTTCCACCGCTGTTCGGCGCGCAGCTTGCGACCGAGGACGCCGAAGGGGAACGGATTACGATCCAGGGAACGATCACGGACGGAGAGGGGGCCATGGTTCCCGATG CCTTGATCGAGATCTGGCAGCCGGACGGGCAGGGGCGTTTTGCTGGAGCCCATCCAGAGCTGCGGAATTCGGCCTTCAAGGGCTTCGGGCGCCGCCACTGTGACAAAAGCGGAAACTTCA GTTTCCAAACCGTGAAGCCTGGCCGGGTGCCCACTGCCGACGGCGTGATGCAGGCACCCCATATCGCTTTGTCGATCTTCGGCAAGGGATTGAACCGCCGGCTCTATACGCGGATCTACT TCGCAGACGAGGCATCGAATGCCGAGGACCCCGTTCTGTCGATGCTGTCCGAGGATGAGCGCGTGACCCTGATCGCCACCTCTGAATCGCCCGCCGCATATCGCCTCGACATCCGCCTGC AAGGCGACGGCGAAACGGTGTTTTTCGAGGCCTGAGTCGGCCGGCAAGTTTGCGGGGATCCGTCCGCCGCAATTGTGTTTCGCTATAGACGCCACGGCTGCCGCATGCCGCCGGGTGGAA GGGCCTTGCAAGGCCTGTCAACGGCGGAGTAAAATCCGGCCAGGCGGCGGAGTAAAACCAGGCCACTTGTGGCCCACGCATGAGACACCCGGGAGGGCGTAGCCCAAGCGGGGGTCTCAT GCGTGTGCGGCGGTTTTCTGGGGGTTCAGCCAGCCTTGCGGGCGCGGCTTTGAGCGAGACGATAGCTGTCGCCGTTCATCTCGAG

62 Fehérjeszekvenciák összehasonlítása

63 Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis
Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar2 Ar: antibiotikum rezisztencia Ar2 oriT oriV Ar1 Ar2 vad típus mutáns poláris hatás

64 Génsűrűség különböző élőlényekben
Table 20.1

65 Dot-blot technika Reverz dot-blot technika DNS-chip technika
Radioaktív génspecifikus próba Dot-blot technika A pozitív RNS minták jelölődnek Különböző sejtekből preparált teljes RNS-ek szilárd hordozóra kötve Hibridizáció Teljes RNS jelölése Reverz dot-blot technika Génspecifikus minták rögzítése szilárd hordozóhoz Hibridizáció Pozitív génspecifikus minták jelölődnek Hibridizálás DNS-chip technika 100-20,000 Génspecifikus minta DNA-chip Lab.BRC, Szeged

66 Alkalmazások, humán génterápia
Figure 20.16 Bone marrow cell from patient Retrovirus capsid Viral RNA Cloned gene (normal allele, absent from patient’s cells) 2

67 Alkalmazások, transzgenikus állatok
Figure 20.18

68 Agrobacterium tumefaciens
Alkalmazások, transzgenikus növények APPLICATION Genes conferring useful traits, such as pest resistance, herbicide resistance, delayed ripening, and increased nutritional value, can be transferred from one plant variety or species to another using the Ti plasmid as a vector. TECHNIQUE Transformed cells carrying the transgene of interest can regenerate complete plants that exhibit the new trait conferred by the transgene. RESULTS 1 The Ti plasmid is isolated from the bacterium Agrobacterium tumefaciens. The segment of the plasmid that integrates into the genome of host cells is called T DNA. 2 Isolated plasmids and foreign DNA containing a gene of interest are incubated with a restriction enzyme that cuts in the middle of T DNA. After base pairing occurs between the sticky ends of the plasmids and foreign DNA fragments, DNA ligase is added. Some of the resulting stable recombinant plasmids contain the gene of interest. 3 Recombinant plasmids can be introduced into cultured plant cells by electroporation. Or plasmids can be returned to Agrobacterium, which is then applied as a liquid suspension to the leaves of susceptible plants, infecting them. Once a plasmid is taken into a plant cell, its T DNA integrates into the cell‘s chromosomal DNA. Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid Site where restriction enzyme cuts T DNA DNA with the gene of interest Recombinant Plant with new trait Figure 20.19

69 Alkalmazások, kriminológia, apaság, anyaságvizsgálat
Defendant’s blood (D) Blood from defendant’s clothes Victim’s blood (V) D Jeans shirt V 4 g 8 g

70 Alkalmazások, környezetvédelem
Olaj, Klórozott szénhidrogének, Bármilyen ártalmas anyag 16 h 84 h

71 Igény biológiai eltávolításra
Szulfonált aromás vegyületek lebontása Nitrokémia Rt. elfolyó szennyvízben nagy mennyiségű szulfanilsav azofestékek, növényvédőszerek, antibiotikumok alapanyaga Igény biológiai eltávolításra Izoláltunk egy baktériumot, mely képes a szulfanilsavat, mint egyedüli szén-, nitrogén- és kénforrást hasznosítani ezzel a tulajdonságával egyedülálló a világon

72 A SZULFOKATEKOL DIOXIGENÁZT KÓDOLÓ GÉNEK KROMOSZÓMÁLIS RÉGIÓJA
orf pcaB orf macA orf pcaH pcaG istB pSC1/48 (7404 bp) gene length (aa) function homology (%) orf1 259 hypothetical conserved protein pcaB ~ 450 3-carboxy-cis-cis muconate cycloisomerase 40-45 orf2 319 putative hydrolase 40 macA 359 maleil acetate reductase 45-55 orf3 395 putative oxidase pcaH 245 proto(sulfo)catechol-3,4 dioxygenase beta subunit 80, 67, < 60 pcaG 195 proto(sulfo)catechol-3,4 dioxygenase alfa subunit 64, 61, istB 19 IS21 transposase, C-terminal end 100 N H 2 S O 3 C szulfanilát 4-szulfokatekolát szulfomukonát szulfolakton maleilacetát - trikarbonsav ciklus P340 II 3,4 dioxigenáz NADH+H NAD HSO + 3-karboximukonat cikloizomeráz szulfolakton hidroláz maleilacetát reduktáz ? A SZULFOKATEKOL DIOXIGENÁZT KÓDOLÓ GÉNEK KROMOSZÓMÁLIS RÉGIÓJA